草鱼肝胰脏碱性磷酸酶的分离纯化及性质的研究.pdf

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1、第33卷第8期水产科学VoL33NO．82014年8月FISHERIESSCIENCEAug．2O14草鱼肝胰脏碱性磷酸酶的分离纯化及性质的研究马金虎，薛福来，王一帆，林亚秋，沙亚娟，伍红，贺庆华(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041)摘要：为获得草鱼肝胰脏的碱性磷酸酶，并阐踞其性质，利用Tris—HCl(pH7．5)缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀分离和葡聚糖凝胶(SephadexG-150)等步骤对草鱼肝胰脏碱性磷酸酶进行分离纯化，测定碱性磷酸酶的动力学性质，研究金属离子对碱性磷酸酶活力的影响。试验结果表明，得到提取倍数为7．3倍、比

2、活力为949．8U／mg的碱性磷酸酶，酶液经SDS-PAGE呈一条带，其亚基的分子量约54ku。动力学测定结果显示，该酶催化对硝基磷酸苯二钠水解反应的最适pH为lO．33，最适温度为38℃，米氏常数为9．03mmol／L，最大反应速度为1．5／~mol／(L·min)。Li、Na、K对碱性磷酸酶活力影响不大；Ba”、Ca、Mg、Mn能激活碱性磷酸酶活力；EDTA、Cu和Zn抑制碱性磷酸酶活力。研究结果可为碱性磷酸酶在鱼类脂质代谢中的作用提供参考和依据。关键词：草鱼；肝脏；碱性磷酸酶；分离纯化；性质中图分类号：$965．112文献标识码：A文章编号：1003—1

3、11l(2O14)08—0498—05碱性磷酸酶是广泛存在于动物、植物和微生物和治疗提供参考。体内的一种对底物专一性较低的磷酸单酯水解酶。1材料与方法碱性磷酸酶对生物代谢过程的调控作用主要体现在维持体内适宜的钙磷比例，参与包括角蛋白在内1．1材料等蛋白质的合成及分泌途径，在骨骼形成和脂类代草鱼购自成都市洗面桥菜市场，用解剖剪刀的谢中均有重要作用[1]。如碱性磷酸酶可作为临床背直接击打头部至其死亡，迅速取其肝胰脏组织，上检测肝脏、骨骼和癌症等疾病的诊断指标[3]。放入冰箱中，一20℃保存备用。研究显示，不同物种中其提取出来的碱性磷酸酶的1．2方法性质不同，即使同

4、一物种不同组织提取的碱性磷酸1．2．1酶的分离纯化酶性质也不同，说明该酶具有特异性。目前对于碱用预冷的双蒸馏HO漂洗从冰箱中取出的草性磷酸酶的研究多集中于哺乳动物、禽类和贝鱼的肝胰脏组织，然后用眼科剪刀剪碎，加入预冷类[7]，在鱼类中的研究较少。的0．05mol／LTris—HCl缓冲液(含0．1mol／L草鱼(C￡P0^nryg00idellus)是我国特有NaC1pH7．5)匀浆5min，吸出匀浆液放人4℃冰的四大家鱼之一，具有重要的食用价值和经济价箱抽提过夜。翌日取出后，4℃，12000r／min离心值。肝胰脏是草鱼体内最大的消化腺，在生长发育30min

5、，加入与上清液等体积预冷的正丁醇4℃过过程中发挥着重要作用。近年来养殖发现，肝胰脏夜以去除脂肪。第2d取出后，4℃，12000r／min疾病是影响草鱼后期养殖的主要病害，因此寻找肝离心20min，取上清液加入硫酸铵固体至30饱和胰脏疾病的标志物对其预防和治疗尤为重要。本度，4℃冰箱静止5h后，12000r／min离心2O试验用有机溶剂沉淀和盐析法结合提取草鱼肝胰min，弃沉淀，再加人硫酸铵固体至7O饱和度，静脏的碱性磷酸酶，分析其酶学性质与影响活力因止5h后，4℃，12000r／min离心2Omin，弃上清素，为研究碱性磷酸酶在草鱼脂质代谢中的调控作液。用预冷

6、的0．05mol／LTris—HC1(pH7．5)缓用提供基础资料，并同时为草鱼肝胰脏疾病的预防冲液溶解沉淀，获得粗酶制剂。将获得粗酶制剂过夜收稿日期：2013-10—07；修回日期：2014—03—04．基金项目：四JII省高等教育质量工程建设项目子项目一大学生创新性实验项目；西南民族大学校学术带头人培养基金资助项目．作者简介：马金虎(199O一)，男，本科生；E-mail：majinhu12306@sohu．com．通讯作者：林亚秋(1976一)，女，副教授；研究方向：动物肉质调控．E—mail：linyq1999@163．corn．第8期马金虎等：草鱼肝

7、胰脏碱性磷酸酶的分离纯化及性质的研究透析后进行离心，用SephadexG-150(Pharmacia，最适温度。USA)凝胶过滤，先用双蒸馏H：O冲低压层析系统，1．2．7酶的热稳定性的测定流速为30ml／min，再进行柱层析，用0．05tool／在上述的测酶活的体系中，加入用不同温度和LTris—HCl(pH7．5)缓冲液平衡柱子，流速为2．0不同时间处理的碱性磷酸酶酶液，在梯度PCR仪中mL／min，上样：流速为1．0mL／min，洗脱：0．05mol／进行，处理温度分别为：25、3O．1、36、41．2、46．3、LTris—HC1缓冲液(含0．2mol

8、／LNaC1pH7．5)，流5O．3℃