菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究.pdf

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1、第42卷第7-8期2012年7月中国海洋大学学报PERI()DICAL()FO(=EANUNlvERSITYoFCHlNA42(7-8)：033～037July。2012菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究。焉翠蔚，随建强，王镇，赵庆娅，黎玲屹(中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003)摘要：经Tris—HCI缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAESepharoseFastFlow离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析等步骤．从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶，SDS-PAGE显示为单一条带，提纯倍数为14．42，比活力达到131．08U

2、／mg。酶学性质研究表明：该酶哑基分子量约44kD。最适反应温度为45℃，最适pH值为9．0，米氏常数K。为0．098mmol／L，最大反应速度’，盯。为1．01／umol／(mL·min)。Ca”、Mg+对酶活力表现出显著的激活作用。关键词：菲律宾蛤仔；碱性磷酸酶；分离纯化；酶学性质中图法分类号：Q556文献标志码：A文章编号：1672—5174(2012)7—8—033—05碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AI。P)是广泛分布在植物、动物和微生物体内的一种莺要调控酶，可催化各种磷酸基团的水解和转移反应[1]。在鱼类体内，AI．P参与葡萄糖、脂类、

3、无机磷及钙的吸收口]；在甲壳动物体内，ALP参与钙质的吸收、磷酸钙的形成及甲壳素的分泌口1；在贝类体内，ALP还与维持钙磷比例及角蛋白的分泌直接相关，在贝壳形成过程中起到重要作用[4]。经过纯化的ALP用途也十分广泛，常被应用于核酸、毒物学、医学研究；添加ALP的化妆品有助于皮肤细胞的新陈代谢及再生，AI。P也是基因工程中常用的工具酶L5]。目前，国内外学者已经从北极虾、海洋弧菌、大西洋鳕鱼、希瓦氏菌属、南极细菌TAB5、南方鲇、背角无齿蚌、锯缘青蟹、合浦珠母贝、长牡蛎和鲍鱼体内纯化出ALPE}”]。但未见菲律宾蛤仔ALP的纯化研究。本研究以菲律宾蛤仔为材料，分离纯化A

4、I。P，研究其酶学性质，为AI，P的规模化生产提供新的实验材料，同时，也为其在基因工程、医学、化妆品等领域的应用提供重要的参考价值。1材料与方法1．1材料鲜活菲律宾蛤仔购自青岛市齐东路水产市场，置海水中静养24h，使其排出体内泥沙和代谢物。1．2试剂与仪器EDAE-SepharoseFastFlow为GE—Healthcare产品；对硝基苯磷酸二钠(PNPP)和8一巯基乙醇为Am—resco产品；牛血清白蛋白、Tris、SDS、TEMED和考马斯亮蓝@250均为Sigma产品；SephadexG-75为Pharmacia产品；其余试剂均为国产分析纯。2800紫外可见分光

5、光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；电脑恒温层析柜，上海沪西分析仪器厂有限公司；双垂直电泳槽，北京市六一仪器厂。1．3方法1．3．1菲律宾蛤仔ALP的分离纯化冰盒上取菲律宾蛤仔内脏团，按1：3(m／v)的比例，加入4℃预冷的0．05mol／LTris—HCI缓冲液(pH=9．o)，匀浆lmin，然后置于4℃冰箱中浸提4h。4℃条件下，7155×g离心30min。向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至40％饱和度，边加边搅拌，4℃静置2h后，置于冷冻离心机中4℃，7155×g离心30min，收集

6、沉淀，用适量的缓冲液溶解，透析脱盐后上DEAE—SepharoseFastFlow层析柱(10rrmlX200mm)，采用线性梯度洗脱，洗脱液为0．025mol／LTriS_HCl缓冲液(pH=9．0，含氯化钠浓度梯度o～o．5mol／I，)，流速为ln1L／min，5mL／管，收集合并活力峰，透析脱盐后冷冻干燥成固体。最后上SeptmdexG-75层析柱(1L3TI×40cm)，用0．025mol／LTfis—HCl缓冲液(pH=9．o)洗脱，流速为0．3mL／rain，3mL／管，收集活力峰，透析脱盐后冷冻干燥得纯品酶，--20℃保存以备用。1．3．2纯度鉴定及亚基

7、分子量测定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法D4]。1．3．3酶的最适反应温度及温度稳定性研究最适反应温度：在pH=9．0条件下，分别测定AI。P在25、30、35、40、45、50、55、60和65℃反应体系中的酶活力。每个温度设3个平行，取平均值。以反应温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。·基金项目：青岛市科技计划荩础研究项日(11—2—4-1一(9)-gch)I中国海洋大学本科生研究发展计划项目(1112010514)资助收稿I：t期：2011-06—22；修订日期：2012-02—12作者简介：焉翠蔚(1963一)