资源描述：
《层析原理与技术.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在PPT专区-天天文库。
1、层析原理与方法内容提要1、层析原理与技术2、层析方法凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析层析的起源和原理起源----1906年，俄国植物学家Tsweet原理----利用物质分配系数不同达到分离目的层析原理Chromatography层析色谱什么是蛋白层析根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离极性/疏水性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX大小与形状：size/mass(diffusion,sed
2、imentation)GF结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离层析原理分离机制分子的大小-----凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子排阻）分子的电性-----离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换分子的表面疏水结构-----疏水层析（HIC），反相其它：羟基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析精制（polishing）：高分辨率层析分离机制层析的基本概念流动相固定相C流出
3、组份123123洗脱峰层析原理层析的基本概念固定相：固定相是层析的一个基质，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。（在柱层析中称其为层析填料。）它对层析的效果起着关键的作用。层析原理流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体等。（柱层析中一般称为洗脱剂。）Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water层析方法凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换Hydrophob
4、icInteraction疏水层析Affinity亲和层析CHT羟基磷灰石层析原理凝胶过滤层析/分子筛分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。凝胶过滤1.Sphericalparticlespackedintoacolumn2.Sampleapplied3.Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinand
5、outofmatrix4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorder ofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.DiffusionBufferDiffusionintotheporesDiffusionoutoftheporesBuffer凝胶过滤凝胶过滤层析分离纯化原理Stericexclusionleadstoearlyelution按照分子量大小洗脱大分
6、子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶的选择柱长的选择分离：30－120cm脱盐：30cm以下洗脱液离子强度低高离子作用排阻作用（0.1-0.5M)疏水作用pH——中性流速，根据层析介质的
7、说明，一般很低样品容量：1－3％CV凝胶过滤层析操作参数选择1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/302.脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点：层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从而设备成本很高；上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造
8、成样品的损失和增大工艺的复杂性；工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；分辨率低；不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步，或离子交换上样前的脱盐离子交换层析离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交
