坦布苏病毒在Vero细胞上的适应性培养.pdf

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1、·28·《上海畜牧兽医通讯》2015年第3期坦布苏病毒在Vero细胞上的适应性培养李鑫(上海市动物疫病预防控制中心上海201103)【摘要】本研究将经SPF鸡胚传代4次的坦布苏病毒尿囊液接种于Vero细胞并进行连续传代，分别取第5、10、15、20、25、30、35、40和45代病毒测定其TCID。并鉴定。结果显示，第1代病毒培养1周后才能观察细胞病变；传至第2O代后，第3d就能观察到细胞病变；通过RT—PCR扩增E蛋白全基因鉴定，确定为坦布苏病毒引起的细胞病变；TCID。测定显示病毒滴度逐渐升高并达到稳定，表明成功获得了能在Vero细胞

2、上稳定培养的坦布苏病毒，为进一步建立坦布苏病毒的诊断方法、研制新型疫苗奠定了基础。关键词：坦布苏病毒；Vero细胞；培养坦布苏病毒(Tembusuvirus)病是一种引起雏传代45次，每次都设未接毒Vero细胞作对照。鸭、雏鹅发病死亡，种鸭、蛋鸭及种鹅产蛋量下降甚1．4病毒的RT—PCR鉴定至停产的新疫病。主要临床表现为高热、精神欠分别取第5、l0、15、20、25、30、35、40和45代病佳、采食量下降、产蛋量急剧下降甚至停产，死亡率毒，按照MuhisourceTotalRNAMiniprepKit试达5～15；主要病变表现为出血性卵

3、巢炎、间质剂盒的说明书提取各代病毒的总RNA，根据潘金金性肝炎及非化脓性脑炎。该病起初在我国南方大等设计的E蛋白全基因引物：TVE—F：5’一GT—部分地区广泛流行，而流行病学调查发现北京、河TAATGTTAATAGCCCCAGCGTA一3’，TVE—R：北、河南及山东等北方地区也有该病的感染。该病5’一TTTCAATTCTTTCCTAGCCAAGTC一3’，扩对养禽业的发展危害严重，而目前尚无有效防治方增各代病毒的E蛋白基因，片段大小为1572bp，同法。由于坦布苏病毒在鸡胚上的传代并不稳定，某时设阳性和阴性对照。RT—PCR扩增条件为

4、：95℃些代次出现了不能顺利传代的情况，本研究主要将预变性4min；94oc变性45S，51℃退火45S，72℃在鸡胚上连续传代4次的无菌尿囊液在Vero细胞延伸1min45S，共35个循环；72℃延伸10min。上进行连续传代培养，以期获得能在Vero细胞上1．5病毒TCID5。的测定稳定传代的坦布苏病毒，为后续疫苗的研制及检测取生长状态良好的Vero细胞铺于96孔细胞培方法的建立奠定基础。养板，置于37℃、5C()2培养箱中培养。将第5、10、1材料与方法15、2O、25、3O、35、40和45代病毒10倍系列稀释，取1．1毒株与细胞

5、系10。。～109个稀释度的样品，每个稀释度接种4个鹅源坦布苏病毒(SHYG)由本实验室分离鉴定孔，同时设未接毒Vero细胞对照，置于37℃、5V0并保存。，非洲绿猴肾细胞(Veto)购自中国科学院CO。培养箱中培养5～7d后，做间接免疫荧光实验。细胞库。用Reed-Muench法计算出各代的TCID~o。1．2主要试剂2结果DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；2．1病毒的传代抗生素购自上海生工生物工程有限公司；Multi-将无菌尿囊液接种于Vero细胞后，每天观察sourceTotalRNAMiniprepKit试剂盒购自A

6、xy—细胞状况，到第7d发现有细胞皱缩、变圆，第9dgen公司；琼脂糖购自美国Sigma公司。大部分细胞都发生病变。收集细胞和上清液继续1．3病毒的传代传代至第10代，发现到第5d细胞就有肉眼能观取生长状态良好Vero细胞，接种已在鸡胚传察到的病变，第7d大部分细胞发生病变。继续传代4次鹅源坦布苏病毒SHYG株的无菌尿囊液，每代至20代，到第3d细胞就开始皱缩变圆，第5d天观察细胞病变，待出现细胞病变后同时收集细胞大部分细胞发生病变。继续传代至45代，细胞出和上清液。冻融3次后离心取上清液，以同样的方法现病变的时间和细胞病变情况与第2O代

7、基本相接种Vero细胞。按照此方法在Vero细胞上连续同(图1)。