水稻幼苗叶片应答稻瘟病侵染的差异蛋白谱分析.pdf

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1、第l3卷第4期淮阴师范学院学报(自然科学版)、／01．13NO．42014年12月Dec．2014水稻幼苗叶片应答稻瘟病侵染的差异蛋白谱分析唐成，陈露，安敏敏，孟丹。，杨立明，罗玉明(1．淮安市高新技术创新中心，江苏淮安223301：2．淮阴师范学院生命科学学院江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，江苏淮安223300：3．南京师范大学生命科学学院，江苏南京210046)摘要：为了探讨水稻感病基因型种质响应稻瘟病侵染的蛋白质表达谱的变化规律和作用途径，以水稻感稻瘟病种质日本晴为材料，采用接种稻瘟病菌分生抱子悬浮液，24，48和72h后提取叶片蛋白质，采用

2、iTRAQ蛋白质组学技术研究稻瘟病胁迫下水稻叶片蛋白质组的变化．结果表明，稻瘟病侵染诱导了水稻幼苗叶片内涉及氧化还原平衡、防御、信号传导、糖和能量代谢、氨基酸代谢、光合作用，以及蛋白质代谢等代谢途径相关的53个蛋白质的表达量发生了改变．GO分析表明稻瘟病主要调控了植株体内细胞内平衡、代谢过程和蛋白质代谢等生物学过程．稻瘟病侵染激活了活性氧代谢、防御，以及热休克蛋白等相关的途径，而抑制了蛋白质生物合成过程．结合这些差异表达蛋白的丰度变化结合它们可能的功能，描绘了水稻应答稻瘟病侵染的蛋白质代谢网络，有助于在蛋白质水平上了解其应答过程．关键词：水稻稻瘟病；差异表达

3、蛋白质；代谢途径；iTRAQ技术中图分类号：S184；$511文献标识码：A文章编号：1671—6876(2014)04-0322．070引言关于水稻抗稻瘟病相关的蛋白质组学研究报道目前尚不多见．Kim等人以萌发的稻瘟病菌分生孢子及附着胞正在形成时的分生孢子为实验材料进行的，结果鉴定了5个新的稻瘟病菌差异表达蛋白，并且进一步研究了差异表达蛋白在附着胞形成过程中的作用．谢娟等发现稻瘟病菌侵染后抗性品种出现了一个表达量非常大的新蛋白．通过分析感抗品种对稻瘟病菌不同的生理学反应可以推测，这个新蛋白与其他表达量增加的蛋白点一样与水稻受稻瘟病菌侵染后引起的应答反应相关

4、，是稻瘟病菌侵染后由无毒基因诱导产生的新的功能性蛋白．朱永生等研究了水稻叶鞘接种亲和与非亲和稻瘟病菌株不同时间的蛋白质表达差异，结果表明，接种亲和与非亲和菌株后，水稻叶片具有相似的也有不同的蛋白质表达差异．并且这些差异无论是在各个处理时问之问内还是在各个处理之间都存在一定的规律性．纵向的比较分析表明，由非亲和反应诱导产生的抗性蛋白质在数量与表达量上均要高于由亲和反应诱导产生的蛋白质．上述以双向电泳结合质谱技术的蛋白组学研究有助于在蛋白质水平上了解水稻水稻稻瘟病抗性的分子机制．目前，基于液相色谱．质谱技术的蛋白质组学技术的快速发展和应用为开展植物重要性状的分子

5、机制的研究提供了一种新的平台．该技术在蛋白质分离的数目和定量的准确性等方面具有更大的优势．本文利用基于同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)的蛋白质组学方法分析了水稻感病种质日本晴幼苗叶片在受稻瘟病菌侵染后的差异蛋白质表达谱的变化，发掘出稻瘟病诱导的蛋白质变化规律，收稿日期：2014-06-06基金项目：江苏省农业科技自主创新基金项目(CX[12]3048)；淮安市农业科技支撑计划项目(SN130127)；江苏省高校优秀科技创新团队资助项目通讯作者：唐成(1982．)，男，江苏沭阳人，农艺师，硕士，研究方向为水稻品质与分子机理研究．E-mail：yumi

6、ngluo@163．con第4期唐成等：水稻幼苗叶片应答稻瘟病侵染的差异蛋白谱分析323同时通过生物信息学技术分析了上述差异表达蛋白的生物学过程、分子功能和细胞定位，并对上述稻瘟病应答蛋白参与的分子网络进行了发掘．1材料与方法1．1水稻幼苗培养和稻瘟病菌侵染实验选用的水稻材料为感病种质日本晴，在智能人工气候箱中用1／2Hoagland营养液培养，昼／夜温度分别为28和26qC，相对湿度为70％一80％．当幼苗长至1叶1心时，进行喷雾接种处理．所接种的稻瘟病病菌菌株为淮安本地的稻瘟病菌混合生理小种．对照材料是在水稻幼苗的叶片上均匀喷雾接种缓冲液，接菌处理株则是

7、在叶片上喷雾接种．在接种后的第24，48和72h取样．每个样品设置3个重复．1．2蛋白质的提取水稻幼苗叶片在液氮中研磨，按照1：10(W／V)加入裂解液(7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4％CHAPS)，涡旋混匀．室温下超声60S，浸提30min．然后在10'E下，14000rpm，离心1h，小心取出上清液，并用Bio．Rad蛋白定量试剂盒进行定量．上清液分装后冻存于一80~C．1．3蛋白质酶解和iTRAQ标记取200／xg蛋白溶液置于离心管中，加入4还原试剂，60反应1h，加入2半胱氨酸-阻断剂，室温10min．将还原烷基化后的蛋白溶液加入超滤管中，1

8、2000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液．加