某猪场1例猪瘟病毒的实验室诊断报告.pdf

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1、江苏农业科学2012年第40卷第11期一2l1一程汉，曹军平，史明基．某猪场1例猪瘟病毒的实验室诊断报告[J]．江苏农业科学，2012，40(11)：211—213某猪场1例猪瘟病毒的实验室诊断报告程汉，曹军平，史明基(1．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州225300；2．江苏省兴化市兽医站，江苏兴化225700)摘要：近年来各猪场非典型症状和繁殖障碍型猪瘟增多，一旦发生猪瘟往往病情严重，症状明显，且经济损失严重。非典型猪瘟增多，临床症状与病理变化不典型，必须依赖实验室诊断才能确诊，发病率与死亡率显著降低，病程明显延长。兴化某养殖户送检一发病仔猪，视诊无典型症状，周身皮肤只有3处指甲大小的出

2、血斑，剖检后疑似猪瘟。用病猪血毒进行人工攻毒试验，出现和送检病猪相同临诊症状，扑杀攻毒仔猪后，剖检情况同送检病猪相似。进一步用病猪病变组织进行直接荧光抗体染色试验和RT—PCR诊断，结果均为阳性。关键词：猪瘟；人工攻毒；荧光抗体染色；RT—PCR诊断中图分类号：$828．4文献标志码：A文章编号：1002—1302(2012)11—0211—0237℃染色30min。取出标本片，用吸管吸PBS液冲去玻片上1材料与方法的荧光抗体，然后置大量PBS液中漂洗5次，每次3min，再用1．1材料蒸馏水冲洗晾干。滴加pH值为9．0的缓冲甘油，封片，供镜疑似猪瘟病猪为兴化某养殖户于兽医站就诊的病例。病检。试

3、验设阳性对照、自发荧光对照和抑制试验对照。自发猪精神不振，喜卧；对外界刺激反应淡漠，眼睛不睁，耳后有蚕荧光对照用PBS液代替荧光抗体染色，抑制试验对照的标本豆大小不规则出血斑，后肢内侧有2处同等大小的出血斑。上加未标记的猪瘟抗体，置湿盒内37℃30min后，用PBS液剖检病理变化如下：皮下有出血点；淋巴结肿大不明显⋯；肾漂洗，再加标记抗体，染色同上。脏色淡，不肿大，有少量的小点出血；脾脏边缘梗死；喉头黏将染色后的标本置于荧光显微镜下观察。先用低倍物镜膜、会厌软骨、膀胱黏膜、心外膜、肺及肠浆膜、黏膜有出血。选择适当的标本区，然后换高倍物镜观察。阳性对照呈黄绿结合视诊和剖检结果，疑似猪瘟。色荧光，

4、猪瘟自发荧光对照组和抑制试验对照组应无荧光。攻毒用仔猪购自兴化郊区某个体猪场，未进行猪瘟疫苗黄绿色闪亮荧光结果判定标准：“+++”表示黄绿色荧光；免疫接种。猪瘟荧光抗体购白中国兽医药品监察所。RNA“++”表示黄绿色荧光较弱；“+”表示仅有暗淡的荧光；“提取试剂Trizol购自上海生工生物工程有限公司；dNTPMix一”表示无荧光。(2．5mmol／L)和DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限1．4RT—PCR诊断公司；鼠源反转录酶M—MMLV和RNA酶抑制剂RNAsin购1．4．1引物设计与合成根据GenBank中已经发表的猪瘟自美国Promega公司；其他试剂均为国产分析纯。移液器吸病毒基因序

5、列，设计1对引物，用于扩增CSFV全长基因，头和指形管均购自海门市联合塑料制品厂。凡用于RNA操其序列为上游引物P1：5，_CTAGTAACTGGGGCACAAG一3；作的吸头和指形管均用0．01％DEPC水室温浸泡处理24h下游引物P2：5一CGTGGAACAGCAGTAGTA一3。后经121oC高压消毒30min后烘干备用；用于其他操作的吸1．4．2病料总RNA的提取按试剂盒说明书进行。取病头和指形管经121oC高压消毒后使用。猪的脾、淋巴结、扁桃体、肾病料组织块处理上清或抗凝全血1．2动物回归试验6500r／min离心5min。取250p,L加入TrizolReagent病猪血毒颈部肌肉

6、注射非免疫仔猪，另有一免疫仔猪作400，充分混匀，静置10min后加入200冷氯仿，振荡为对照。每隔12h对攻毒仔猪做体温记录及白细胞计数，体混匀，室温下静置3min，12000r／min离心10min。取上层水温升高不明显，白细胞数量呈下降趋势。攻毒前后体温、白细相置于另一离心管中，加入500IxL冷异丙醇，一2O℃放置胞数量及症状记录见表1。5min。12000r／rain离心10min，弃上清，加入40075％冷1．3荧光抗体检查(直接染色法)乙醇(DEPC处理过的超纯水配制)，洗涤，12000r／min离心取5张洁净载玻片编号，分别取脾脏或淋巴结进行触片，10min，37℃烘干。加l7

7、．5DEPC处理水，放入70℃水浴置丙酮中固定10min。将固定好的切片用PBS液漂洗5次，10min。立即使用或一70℃保存(短时间内可一20℃保存)。每次3rain。在晾干的标本片上加猪瘟荧光抗体，置湿盒内1．4．3反转录应用提取的RNA进行反转录。反转录体系各组分为5×RTbuffer5L、dNTP(10mmo1)1．5ILL、AMV(10U／~L)0．5ixL、RNA酶抑制剂(40U／)0