实验四 细的革兰氏染色与芽孢染色.doc

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1、实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcusaureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家ChristainGram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇

2、脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保

3、留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响

4、脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。7.用滤纸吸干，油镜镜检。五、注意事项为了保证革兰氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革兰氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不宜过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。六、实验内容1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。七、实验报告1.图示所观察到的菌体细胞的形态与革兰氏染色结果；2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过24小时？3.在下表中依次填入革兰

5、氏染色所用染料的名称，并填上革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在每步染色后菌体所呈的颜色。在不影响革兰氏反应的前提下，哪一步可被省略？步骤所用染料菌体所呈颜色革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌12344.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确、结果可靠？附录：细菌的芽孢染色一、目的要求学习芽孢染色的原理和方法二、实验材料1.菌种：枯草芽孢杆菌，肉汁斜面培养24h；2.染料：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、香柏油、二甲苯等。三、实验原理芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及

6、芽孢的形状、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的依据。由于芽孢壁厚、透性差、不易着色。当用结晶紫单染色时，菌体呈紫色，芽孢是无色透明。芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用番红复染，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。四、操作步骤1.制备菌悬液加1~2滴水于小试管中，用接种环挑取2~3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。

7、2.染色加2~3滴孔雀绿于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15~20min。3.涂片固定用接种环取试管底部菌液数环于干净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。4.脱色水洗，直至流出的水无绿色为止。5.复染用蕃红染液染色2~3min，倾去染液并用滤纸吸干残液。6.镜检干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊和营养细胞为红色。注意：所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢为宜；取菌不宜太少。