活体电穿孔法辅助HFA基因免疫小鼠制备单克隆抗体.pdf

《活体电穿孔法辅助HFA基因免疫小鼠制备单克隆抗体.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、660ISSN1007～8738细胞与分予免疫学杂志(C—hinJC—ellMo—lhnmuno—1)2010,26(7·论著·文章编号：1007—8738(2010)07-0660—03活体电穿孔法辅助HFA基因免疫小鼠制备单克隆抗体栾好飞一，高新，卞丽红，付洁，邱伟成，董立厚，范礼斌，宋海峰(安徽医科大学基础医学院，安徽合肥230032；军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850；军事医学科学院附属医院妇科，北京100071)[摘要】目的：采用电穿孔辅助DNA免疫方法制备小鼠抗1材料和方法人附睾蛋白

2、4(HE4)单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进1．1材料BALB／c雌性小鼠(8～1O周龄，体质量18—20g)购行鉴定。方法：利用逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)从卵巢癌白军事医学科学院动物中心[SCXK(军)2007—004]；卵巢癌患者组织中获得人HE4基因编码序列，将其亚克隆至组织由军事医学科学院附属医院提供；骨髓瘤细胞为本室保pPICZc~A表达载体中并测序鉴定。采用活体电穿孔法免疫存；聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)4000，次黄嘌呤一氨基BALB／c小鼠。单抗制备采用B

3、淋巴细胞杂交瘤技术进行细喋呤一胸腺嘧啶(hypoxanthine-aminopterin—thymidine，HAT)，胞融合，经多次克隆化培养，筛选出特异分泌鼠抗人HE4次黄嘌呤一胸腺嘧啶(hypoxanthine—thymidine，HT)，Ig亚类检mAb的杂交瘤细胞株。采用Westernblot，Ig亚型分析和mAb测试剂盒均为Sigma产品；四甲基联苯胺(3，3，5，5'-tetram-ethylbenzidine，TMB)为N~gene公司产品；RPMI1640培养基表位分析等对mAb的生物学特性进行

4、鉴定。结果：获得2株为Gibco—BRL公司产品；优质胎牛血清购于杭州四季清生物持续、稳定分泌鼠抗人HE4mAb的杂交瘤细胞株，命名为1—工程有限公司；HE4蛋白由本室制备；山羊抗小鼠ISG·HRP7-C和3．12．C。ELISA和Westernblot结果均显示本实验获得和小鼠抗HismAb为中杉金桥公司产品；总RNA提取试剂、的2株mAb能够特异识别有天然构象的HE4蛋白，2株mAb质粒大提试剂盒、RT—PCR试剂盒、Westernblot相关试剂购的Ig亚类均为IgM，轻链均为入链。结论：成功地构建了自TI

5、ANGEN生物公司。核酸内切酶和T4连接酶为NEB公司pPICZc~A-HE4表达载体，并获得2株鼠抗人HE4杂交瘤，其产品；酶为TaKaRa公司产品；硝酸纤维素膜购自Amer-所分泌的抗体能特异地识别HFA蛋白。sham公司；pPICZctA质粒由本室保存；PCR扩增仪为东盛公[关键词]卵巢癌；HE4；活体电穿孔；DNA免疫；杂交瘤；司制造；基因脉冲导入仪为天津理工大学制造；引物合成和单克隆抗体测序由上海生工完成。[中图分类号]Q813．2[文献标识码]B1．2方法1．2．1表达载体构建及鉴定根据GenBank

6、中HFAcDNA人附睾蛋白4(humanepididymisgeneproduct4，编码序列(GenBankaccession：AY212888)设计引物，上游引HE4)基因产物在卵巢癌组织中高表达，但在正常组物5，_GGAATFCATGCCTGCTYGTCGCC一3含EcoRI酶切位点织包括卵巢组织中不表达或低表达¨～，在辨别恶(划线处)，保护碱基，起始密码子。下游引物5'-ACGC一性和良性肿瘤方面特异性较好。，因此HE4是有GACACAGAAATrGGGAGTGAC-3含SalI酶切位点(划线望成为卵巢癌

7、早诊的候选肿瘤标志物之一。抗体制处)，保护碱基。按照说明书用TRIzol试剂从卵巢癌组织中备是制备免疫诊断试剂的核心技术，当无法获得大提取总RNA，通过RT—PCR获得HE4基因，将EcoRI和SalI酶切的HE4基因与同样酶切的pPICZotA质粒置16~C水浴过量纯化的蛋白抗原时，采用基于电穿孔辅助的DNA夜连接，连接产物转化TOP10感受态细菌，37~C摇菌，按试免疫，能有效实现DNA的体内递送，并激发机体的剂盒说明书提取质粒，通过酶切及测序方法对质粒进行鉴定。免疫应答，更易得到针对天然抗原的高效价抗1．2

8、．2动物免疫将含pPICZ~A．I4FA的大肠杆菌扩大培养，体_6～。本实验中，我们从卵巢癌组织中获取HFA按质粒大提试剂盒说明书提取质粒，用无菌PBS溶解，紫外编码基因，并将其亚克隆到pPICZotA表达载体中构分光光度法检测质粒浓度和纯度。采用核酸电穿孔法免疫小建表达质粒pPICZaA．HE4，通过活体电穿孔法免疫鼠。首先，在BALB／c雌性小鼠后腿肌肉内注射约3O质