抗体生产纯化技术进展.pdf

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1、●-_ii一、单抗技术的发展、应用和市场前景二、治疗用抗体生产技术进展自1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单抗2．1新型的两步层析技术与整个纯化工艺药物Rituxan，Anti—CD一20抗体上市，并进人56个国家，MabSelectSuRe的卓越性能以及CaptoAdhere的复至2007年，FDA已批准了20多种治疗性单抗药物，约合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转一半用于治疗癌症(详见附录1)，多个已成为年销售额变为两步层析得以实现。FDA前验证顾问GailSofer在超十亿美元的“炸弹药物”(BlockbusterDrug，图1)。接受采访

2、时表示，两步层析在验证、内毒素的去除等问全球抗体药物的市场增长十分迅猛，有约200多种单抗题上都不会存在障碍。。两步层析的整个工艺该怎样设计在临床实验，占整个临床生物技术药品总数的三分之一才能够最大化我们的收率甚至产率，而又保证我们的产多，其中四分之一在临床三期或等候批准。预计单抗的品完全合格呢?因此除了两步层析工艺外，还需要在整全球销售额将从2004年的5O多亿美金增至2010年的个纯化工艺上做文章。300多亿美元，年均复合增长达到30％。整个抗体市场在细胞培养表达以后，采用0．2—0．45um的中空纤维(包括多抗)2007年即已经达到210多亿美金(表1)。膜技术

3、进行澄清(Cellremova1)，然后用MabSelectSuRe2000年人类基因组序列初稿的完成，近年蛋白质组和结捕获，酸性条件洗脱后直接pH4．0病毒灭活，澄清过滤构基因组技术的蓬勃发展，也给抗体研究带来更多机遇后穿透方式上CaptoAdhere，这一步离子交换之前或之和挑战。而高细胞密度培养及表达技术、高表达细胞株后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和构建技术以及大规模蛋白质纯化技术的发展则极大的推洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如下图2，这一工艺平台动了抗体产业化的发展。已经尝试过多个不同的抗体(表2)并取得成功，同时很多实验表明这一工艺平台适合

4、多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通过增加一步CaptoQ也基本上可以达到要求或是采用CaptoS—CaptoQ的工艺步骤(图11)。2．2高密度细胞培养：Wave细胞培养技术Wave细胞培养技术(图3-4)：治疗用抗体的表达一般采用大规模悬浮动物细胞培养，常用的细胞系为CHO和NS0，可以选择批式流加或连续灌注的培养方式。连续灌注培养(perfusion)可以避免细胞代谢的废物在反应器中的累积，连续收获培养液的同时不断加入的新鲜培养基以维持恒定的营养物质浓度，使得细胞密度大大增加，从而提高抗体滴度、减少反应器的体积，降生物技术世界2008年10月l3

5、．操作方便、不易污染：Wave生物反应器采用预澄清后的细胞培养液可直接进蛋白A亲和层析进行纯化。先灭菌的无菌无热原细胞培养袋(图23)，材质完全符合中空纤维膜澄清细胞培养液的优势：USPVI标准，即开即用，避免了反应器目常清洗、灭菌1．中空纤维澄清步骤少，速度快，收率更高(通过和验证等操作。细胞培养袋有多种扩展接口，方便的进有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最行DO、pH的在线检测和控制，还可以通过无菌焊接机大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。实现全封闭可移动的生物制品生产。2．成本低：中空纤维膜澄清不仅省去了连续流高速4．验证：提供完整的验证支持文件

6、，符合GMP的离心机昂贵的前期投资和运转的曰常维护成本，还节省生产要求。了离心后死端过滤(NFF)的成本。中空纤维膜物理化学Wave反应器适合批式流加和连续细胞灌注培养(图性质稳定。可以通过清冼而反复使用，成本低廉。24)的方式。目前，Wave反应器进行抗体的生产巳经成3．有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质功放大到500L的规模，抗体表达量和产品质量均与搅可以耐受1NNaOH40—50~C和氧化剂NaC10的清洗，拌式反应器相当。从而有效去除内毒素；封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。．2．3样品澄清：中空

7、纤维膜技术4．低剪切力：中空纤维采用低剪切力(ShearRate=中空纤维膜属于切向流膜分离技术：下游的分离纯4q／pr，q-crossflowincm。(m1)／sec，r—fiberradiusincm)化单元操作包括一系列的膜分离技术和层析技术，膜分的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还离技术通常用于培养掖的固液分离(澄清，代替离心避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利机)，样品的浓缩、纯化中间产物的缓冲液置换以衔接不于抗体的稳定。同的层析步骤，以及终产品的制剂和无菌过滤等；而层5．工艺耐用性强：相比死端过滤，切向流中空纤维