病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化-zsd.doc

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1、病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化：1.将293细胞铺于30-40个10cmdish，至细胞长满，每块板加入合适滴度的病毒（约107-108pfu/ml）10µl，感染细胞，待细胞全部病变后（4-7天），每块板中加入约500µl（150ul）10%NonidetP40（NP40）以裂解细胞。收集整个细胞裂解物，如果不是立即做CsCl纯化的话，可放在-80°C冰箱。2.12,000rpm离心10min，弃细胞碎片，收集上清。每100ml上清加入50mlPEG8000（20%PEG8000，2.5MNaCl）

2、，冰上1hr沉淀病毒。3.12,000rpm离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20mMTris-Hcl，pH8.0）。4oC7,000rpm离心5min，收集病毒悬浮液。4.CsCl梯度的制备，用滴管轻轻加入2.0ml的CsCl（密度1.40g/ml，溶剂同上）。再加入3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液。再加入5ml的病毒悬浮液。20,000rpm，室温离心2hr。收集密度在1.30-1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中，

3、透析袋用前用10mM的EDTANa2煮沸10min。在透析缓冲液（将50g蔗糖，10ml1MpH为8.0的Tris-HCl液，2ml1MMgCl2溶液定容至1,000ml）中，4oC透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。三种密度的CsCl溶液配制（溶于灭菌20mMTris中,pH8.0），4℃保存。密度(g/ml)(20℃)浓度(W/V)CsCl量(g)终体积(ml)1．4056%7.84101．3031%4.03101．1012%1.3210