奥沙利铂抑制肝癌HepG2细胞侵袭迁移及β-catenin蛋白表达-论文.pdf

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1、·68·2013年9月第4O卷第l8期ChineseJournalofPracticalMedicineSep．201，：±：奥沙利铂抑制肝癌HepG2细胞侵袭迁移及-catenin蛋白表达王春峰张连峰【摘要】目的观察奥沙利铂(L-OHP)对人肝癌HepG2细胞株侵袭迁移及[3-catenin蛋白表达的影响，探讨L．OHP影响肝癌细胞侵袭转移的可能机制。方法体外培养HepG2细胞株，MTY法检测对照组和L—OHP干预组(5、10、20、40g／m1)干预24、48、72h后HepG2细胞增殖抑制率，Transwell小室测HepG2细胞侵袭、迁移能力，免

2、疫细胞化学S—P法检测L—OHP作用48h后HepG2细胞B—catenin蛋白的表达。结果L-OHP以时间-浓度依赖方式抑制HepG2细胞增殖；5S／mlL．OHP作用24h时，HepG2细胞中侵袭及迁移细胞数明显低于对照组(P<0．01)；与对照组比较，各L-OHP干预组HepG2细胞B．catenin蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0．01)。结论L．OHP抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭及迁移，其作用可能是通过抑制B—catenin蛋白表达而实现的。【关键词】奥沙利铂；HepG2细胞；细胞增殖；侵袭；B-catenin原发性肝细胞癌(prim

3、aryhepatocellularcarcinoma，HCC)(1一实验组OD值／对照组OD值)×100％。实验重复3次。是常见恶性肿瘤，由于起病隐匿，进展迅速，多数患者确诊时已1．2．3Transwell小室测HepG2细胞侵袭、迁移能力：①侵袭实是局部晚期或发生远处转移，如仅采取对症支持治疗，自然生验：取对数生长期细胞，撤血清饥饿24h后消化细胞，离心弃去存时间极短⋯。近年来，以奥沙利铂(oxaliplatin，L．OHP)为主培养液，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至2×的联合化疗推动和启发了晚期肝癌化疗的研究J。Wnt／13．10／ml

4、。将小室放入24孔培养板中，上室加入300预温的catenin信号通路是生物进化过程中高度保守的通路，该通路异无血清培养基，室温下静置30min，吸去培养液。取细胞悬液常活化与肝癌的发生、发展密切相关。本研究通过观察L．200加入Transwell小室，常规培养24h；实验组上室加L-OHP对人肝癌HepG2细胞株侵袭迁移及Wnt／13一catenin信号通OHP使其终浓度为5s／ml，对照组为含10％胎牛血清的路关键因子B-catenin蛋白表达的影响，探讨L．OHP抗肝癌细DMEM，下室加入0．5ml含5％FBS的培养基，培养24h；取出胞生长及转移

5、的分子机制。Transwell小室，PBS洗2次。在倒置显微镜下计数移至微孔膜1材料与方法下层的细胞，每个样本计数5个高倍视野(×200倍)的细胞1．1主要试剂：人肝癌HepG2细胞株(中科院典型培养物保数，每组重复5次。②迁移实验时小室滤膜上不铺Matrigel，细藏委员会细胞库)，奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)，胞密度为2×10／ml，FBS浓度调至2．5％，步骤同侵袭实验。DMEM高糖培养基、四甲基偶氮唑盐(MTr)(美国Sigma公计算细胞的迁移抑制率和侵袭抑制率：细胞迁移抑制率=(1一司)，96孔板、24孔板(青岛爱普科生物工程有限公司)

6、，Tran．L—OHP组迁移细胞数／对照组迁移细胞数)×100％，细胞侵袭swell侵袭小室(8．0m，24孔，Coming公司)，鼠抗人p-catenin抑制率=(1一LK—OHP组侵袭细胞数／对照组侵袭细胞数)×100％。单克隆抗体(SantaCruz公司)，3，3’二氨基联苯胺(DAB)和过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(北京中杉公司)。1．2．4免疫细胞化学S-P法检测L．OttP作用后HepG2细胞1．2实验方法：p—catenin蛋白表达：制备细胞爬片，一20℃冰箱保存备用。免疫细胞化学S-P法检测细胞B．catenin蛋白表达，3-ca

7、tenin一抗1．2．1细胞培养：HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的工作浓度为1：100，空白对照以PBS代替一抗。结果判定：以胞DMEM培养基内，37oC、5％CO培养箱内常规传代培养，取对浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性，随机选取3个视野计数，每数生长期细胞进行实验。个视野记数100个细胞，用每100个细胞中的阳性细胞数的平1．2．2Mqq"法检测细胞增殖抑制率：取对数生长期HepG2细胞制成1×10／ml细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔加液均数，换算成阳性表达百分率。1．3统计学方法：采用SPSS17．0统计软件进行统计学处理。200l。培养2

8、4h后吸尽上清液，加入不同浓度L．OHP，使其方差分析比较各浓度药物组间抑制率的