植物生理生化实验.doc

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1、实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法P199原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。实验步骤：分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入

2、5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100ml。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作试管编号试剂空白1样品1（未萌发）样品2（萌发）2345样品提取液ml02222无氨蒸馏水ml2.000000.1抗坏血酸ml0.10.10.10.10.1水合茚三酮ml33333570nmOD值00.1300.1230.1880.168每管含氮量01.261.191．831.83置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm波长下测

3、定吸光度。样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CVT/VSW*100；C=A/k(k=0.103)；VT=100/2；VS=1；W=1注意事项：1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2.样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3.抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4.水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇；5.稀释后要迅速比色；6.谷物等

4、蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；7.反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。思考题：1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。3.植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？因为植物组

5、织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。4.抗坏血酸在测定中的作用是什么？作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。14722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%。②吸光度模式实验二植物组织可溶性蛋白质含量测定—Folin酚试剂法P188原理：Folin酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物。②络合物和蛋白质中氨基酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使Folin试剂（磷钼

6、酸-磷钨酸试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质。在一定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在650nm，因此可用分光光度法测定其含量。材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。实验步骤：分别取0.5g萌发、未萌发水稻于研钵中+2ml蒸馏水+石英砂，充分研磨，+3ml蒸馏水，定容25ml，放置15min，过滤取上清液备用。如下操作编号123456未萌发萌发牛血清蛋白250ug/ml00.20.40.60.81.0酶0.5酶0.5蒸馏水ml1．00.80.60.40.200.50.

7、5试剂甲ml5摇匀→室温下放置10min试剂乙ml0.5迅速摇匀→室温放置30min650nmOD值0.0000.1120.1540.2550.4740.5510.1670.237蛋白质含量05010015020025071.8104.8样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=XVTN/WVS*1000；VT=25；W=0.5；VS=0.5注意事项：1.Folin酚试剂只有在酸性条件下才稳定；2.试剂甲、试剂乙加入后需要迅速摇匀；3.反应最适温度在25-30℃；4.样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基类化合物均会产生干

8、扰。思考题：1.请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并比较其优缺点。①Folin-酚试剂法优点：灵敏度大、操作简单缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰②考马斯亮蓝G-250法优点：灵敏度大、操作简单缺点：易造成二次污染③紫外分光光度法优点：节约样品、操作简单缺点：准确度差2.测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举例说明。可以测定植物的代谢水平、食品中的营养指标。3.Folin-酚试剂法测定可溶性蛋白的原理是什么？