KSP1基因参与酵母复制寿命调控机制的初步研究-论文.pdf

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1、国际检验医学杂志2014年6月第35卷第l2期ImJLabMed，June2o14，V0I．35，No．12·基础实验研究论著·KSP1基因参与酵母复制寿命调控机制的初步研究赵炜。，牛宇杰。，袁源。，刘新光(1．广东医学院衰老研究所，广东东莞523808；2．广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞523808；3．广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524O23)摘要：目的研究KSP1基因在酵母复制寿命和衰老中的作用。方法利用基因重组原理，构建KSP1基因缺失酵母菌株，检测其复制寿命和增殖速度。结果相对于野生酵母菌

2、株，KSP1基因缺失酵母菌株的复制寿命缩短，增殖速度减慢。结论KSP1基因很可能参与了酵母复制寿命和衰老的调控。关键词：KSP1；酵母；寿命DOI：10．3969／j．issn．1673—4130．2014．12．001文献标识码：A文章编号：1673—4130(2014)12—1521—03RoleofKSP1inreplicativelifespanregulationofSaccharomycescerevisiaeZhaoWei，NiuYujie，YuanYuan，LiuXinguang’’。(1．Institute

3、ofAgingResearch，GuangdongMedicalCollege，Dongguan，Guangdong523808，China；2．KeyLaboratoryforMedicalMolecularDiagnosticsofGuangdongProvince，Dongguan，Guangdong523808，China；3．InstituteoJ、BiochemistryandMolecularBiology，GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，Guangdong524023，Ch

4、ina)Abstract：OectiveToassesstheroleofKSP1inreplicativelii'espanregulationandagingofSaccharomycescerevisiae．Meth-odsKSP1deletionstrainwasconstructedbyhomologousrecombination，thenthereplicativelifespanandcellproliferationabilityofKSP1deletionstrainwereanalyzed．Result

5、sLifespanwasdecreasedandgrowthratewaslowerinKSP1deletionstrain，corn～paredwithwildtypestrain．ConclusionKSP1couldbeinvolvedinreplieativelifespanregulationofyeast．Keywords：KSP1；yeast；lifespan酵母KSP1属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，主要位于细胞1．2方法核中，KSP1基因对于酵母菌的营养生长来说是非必需基1．2．1KSP1基因破坏元件的扩增以质

6、粒pRS306作为因]。KSP1的蛋白结构主要由两部分组成：N端的激酶活性PCR模板，KSP1一URA—F、KSP1一URA—R为引物，扩增含有结构域和C端的天冬酰胺残基结构域。URA3开放阅读框的破坏元件，全长为1232bp。Taq酶采用早期的研究发现KSP1基因在酵母菌丝状生长过程中参的是Iratap，反应体系按照试剂说明书进行，PCR反应条件为：与细胞的核转运过程，过表达KSP1可以拯救酵母Prp20基94℃，1min；94C，30S，58℃，30S，72℃，1min，33个循环；因突变菌株对温度的敏感性。Prp20本

7、身是一种可磷酸化蛋72℃，5min白，但是KSP1基因缺失不会影响Prp20的磷酸化水平]。表1扩增引物序列最近的研究发现，KSP1是细胞自噬的负调节因子，KSP1基因缺失可以促进Atgl3蛋白(TORC1的底物)的磷酸化水平，从而提高细胞的自噬程度。Ras／cAMP依赖性的蛋白激酶PKA可以在一定程度上缓解KSP1对细胞自噬的抑制作用]。细胞自噬可以调节细胞的衰老进程，自噬的很多调控基因都是在酵母中首次发现的[4]。本研究以酿酒酵母作为研究对象，初步研究KSP1基因在酵母复制寿命和衰老中的作用机制，为全面研究KSP1基因的

8、功能奠定基础。1材料与方法1．1材料野生型二倍体酵母菌株BY4743、载体pRS306由美国华盛顿大学MattKaeberlein博士赠送。Latap酶(货号1．2．2KSP1基因缺失酵母菌株的构建将KSP1基因破坏RRO2MA)购自Takara；引物合成、测序由生工生物工程(上元件转化进