毕业论文(答辩定稿王萍)2[1]

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1、分类号Q939学号2006116060硕士学位论文培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响及两株新菌的初步鉴定王萍指导教师曹慧副教授专业名称微生物学研究方向环境微生物工程答辩日期2009年06月EffectofCultivationMethodsonSoilBacterialDiversitybyPCR-RFLPAnalysisandPreliminaryIdentificationofTwoNovelStrainsByWangPingSupervisedbyAssociateProf.CaoHuiADissertatio

2、nSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsforMasterDegreeCompletedinJune,2009CommencementinJune,2009原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全

3、意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者（需亲笔）签名：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”） 学位论文作者（需亲笔）签名：年月日导师（需亲笔）签名：年月日目录摘要IABST

4、RACTIII符号与缩略语说明VII前言IX第一章文献综述1一、土壤微生物的多样性1二、土壤微生物多样性的研究方法4三、未培养微生物的研究进展12四、微生物分类鉴定的研究方法17参考文献20第二章培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响291材料与方法292结果333讨论38参考文献40第三章Phycicoccussp.TR6-7的初步鉴定431材料与方法432结果与分析503结果讨论56参考文献58第四章Humihabitanssp.TR6-11的初步鉴定612结果与分析623结果讨论66参考文献68全文总结71创新之处

5、73附录I攻读硕士学位期间发表的论文73附录II文中所用的培养基和试剂配方75致谢77摘要培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响及两株新菌的初步鉴定摘要提高土壤微生物的可培养性，获得纯培养微生物菌株，是微生物生态学研究的基础。目前由于技术手段的限制，以及人类认识水平的不足，使得自然界中微生物总数的99%还难以用纯培养技术获得分离和培养。因此研究和开发这99%的未培养微生物已成为国内外的一个热点。本论文采用三种营养物质浓度不同的培养基对土壤细菌进行分时段计数，以细菌通用引物扩增细菌16SrDNA片段，用限制性内切酶HhaI

6、酶切PCR产物，对酶切图谱进行分型，研究了不同培养方法对土壤细菌多样性和可培养的影响；本论文还对从土壤中分离得到的两株与其相邻菌种具有较大差别的新菌株（标记为TR6-7和TR6-11）进行了初步鉴定。结果表明，LB、CSEA、WSA培养基192h后每g干土获得的细菌数量分别为14.84×107、10.27×107和6.91×107CFU，但微生物多样性指数以WSA为最高，LB多样性指数最低；三种培养基培养的细菌菌群有一定的相似性，LB和CSEA培养基间的Jaccard指数为57.69%，LB和WSA培养基之间为53.1

7、3%，而CSEA和WSA培养基的相似性指数达66.67%；96～192h细菌的丰富度最高，0～48h细菌丰富度最低，并且三种培养基中单一OTUs类型的43.9%均是在96h后才出现的。16SrDNA测序结果表明，所获得的土壤细菌优势种群在分类方面主要属于γ-和β-变形杆菌以及放线菌亚门，其中某些OTUs中的16SrDNA序列与Burkholderiaceaebacterium、III摘要Rhodococcus和Mycobacterium属具有较高的同源性，推测其细胞能够分泌复苏促进因子，有效地提高土壤细菌的可培养性。T

8、R6-7革兰氏染色反应呈阳性，细胞形态呈椭圆状，无鞭毛和菌毛；最适生长温度为30℃，最适pH值为6.08，最适的盐浓度为2%，无Nacl等盐离子依赖性。TR6-7菌株不能使明胶液化，不能使淀粉水解，V.P.实验为阴性，不能使甲基红变红，不产生氨气，不产生吲哚，但能产生H2S，能使过氧化氢溶液产生小气泡，能使硝酸盐还原。TR6-7能