蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究

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1、蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究摘要天然纤维素（如橘皮、烟梗）是一种可再生生物质资源，但由于纤维素、半纤维、木质素和果胶等交织在一起形成紧密复杂的结构，造成微生物利用天然纤维素生产乳酸、乙醇等的困难。米根霉在一定培养条件下能产生降解果胶质的酶系。果胶酶被广泛用于食品、纺织、生物技术等领域，其市场需求量日益增长。本文采用一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种—米根霉，结合棉布载体固定化细胞的技术进行发酵产果胶酶。采用DNS法测定果胶酶（PEC）酶活力和用粘度法测定聚半乳糖醛酸内切酶（Endo-PG）酶活力。首先从纯果胶发酵产果胶酶出

2、发，考察了固定化发酵与游离发酵差别，优化了纯果胶培养基，优化了培养条件并进行半连续发酵试验，研究了发酵液部分果胶酶酶学性质；然后优化烟梗浸液培养基，优化了培养条件并进行半连续试验，还研究了发酵液中纤维素酶活力变化情况。首先，对纯果胶发酵产果胶酶进行研究。在优化前培养基和培养条件下，固定化和游离发酵相比，固定化发酵48h就达到最大产酶量，缩短发酵时间24h，提高产酶量115%。采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：果胶>Tween80>Zn2+>硫酸铵。发酵培养基为：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween

3、800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%；在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%，转速190r/min、装液量50ml/250ml、发酵温度30ºC、发酵初始pH5.0、初始孢子浓度0.75×106个/mL，培24h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力分别为973.47U/mL和165.08U/mL。通过对粗酶液作用pH和温度的研究，得到PEC和Endo-PG为酸性果胶酶，最适pH为4.5，PEC和Endo-PG最

4、适温度分别为45ºC和55ºC。半连续发酵试验结果表明，在第5批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为1253.95U/mL和181.94U/mL，分别比首次提高29.8%和18.3%。。然后，对烟梗浸液发酵产果胶酶进行研究。采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：烟梗>硫酸铵>Zn2+>Tween80。发酵培养基为：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.05%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%。在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO

5、40.6mmol/L，Tween800.05%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，发酵初始pH5.0，初始孢子浓度0.5×106，，30ºC，装液量50mL，转速170r/min，培养48h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为361.27U/mL和49.22U/mL。烟梗浸液发酵96h，出现纤维素酶活力高峰，滤纸酶活力和羧甲基纤维素钠酶活力分别为33.25U/mL和83.13U/mL。64半连续发酵试验结果表明，在第2批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为430.83U/mL和51.73U/mL，PEC酶活力比首批次提高约22.

6、8%。关键词：米根霉，果胶酶，聚半乳糖醛酸内切酶，固定化，半连续化发酵ABSTRCTNaturalcelluloseisoneoftherenewableresources,suchasorangepeelandtobaccostem,whicharemadeofcellulose,halffiber,ligninandpectin.Theintertwinedcombinationamongthemleadstoformatightandcomplexstructure,whichishardformicroorganismstodigest.Hence,the

7、productionoflacticacidorethanolthroughusingnaturalcellulosebymicroorganismsisfacedwithproblems.Rhizopusoryzaehastheabilitytoproducepectinolyticenzymestodegradepectin.Theremoveofpectincanmakeseparationoffiber,fiberandlignineasier.Thereisagrowingmarketdemandofpectinolyticenzymesforthefa

8、cttha