刺激响应双硒交联聚乙烯亚胺基因微载体.pdf

《刺激响应双硒交联聚乙烯亚胺基因微载体.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、Vo1．35高等学校化学学报No．42014年4月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERS1TIES881～887doi：10．7503／cjcu20130926刺激响应双硒交联聚乙烯亚胺基因微载体孔韵娜，李文宇，杜建委，汤建国，胡巧玲，王幽香(1．教育部高分子合成与功能构造重点实验室，浙江大学高分子科学与工程学系，2．浙江大学医学院附属邵逸夫医院，杭州310027)摘要以丙酸二硒醚为交联剂，通过调节交联剂的用量及反应时间，制备了4种双硒交联聚乙烯亚胺(PEISeSe)，研究了其对脱氧核糖核酸(DN

2、A)缔合能力、质子缓冲能力和转染效率的影响．结果表明，随着交联程度的增大，质子缓冲能力降低．PEISeSe能有效诱导DNA的缔合，当聚合物与DNA的质量比>18时，PEISeSe／DNA组装体可形成150nm的粒子．在模拟细胞内的还原性环境下，双硒键能有效断裂，显示出很好的响应特性．将氯喹与PEISeSe／DNA组装体同时加入到HEK293T细胞中，氯喹的存在有利于PEISeSe／DNA组装体逃离溶酶体．在细胞内高浓度还原型谷胱甘肽的作用下，PEISeSe交联聚合物可被降解为低分子量的PEI片段，有利于释放出DNA并进攻

3、细胞核，提高转染率并降低毒性．关键词双硒交联；聚乙烯亚胺；刺激响应；非病毒基因载体中图分类号O631．3；Q782文献标志码A基因治疗是将外源正常遗传物质[脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)]导人靶细胞，纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，达到治疗目的J．因此，研究具有低毒性、低免疫原反应、易制备等优点的非病毒基因载体成为当今的热点．聚乙烯亚胺(PEI)具有“质子海绵效应”，是最有效的基因载体之一，已成为设计新型聚阳离子基因载体的标准，’]．分子量高于2．5xl0的PEI具有较高的基因转染率，但其在体内不能生物

4、降解，具有较高的细胞毒性；相比之下，分子量低于1．8x10的PEI虽然细胞毒性较低，但很难实现基因的高效转染J．同时，非病毒基因载体设计中的一个关键问题是如何解决DNA和基因载体在传递过程中的稳定缔合和在细胞内的解离并高效释放表达这一对矛盾’mj．由于细胞内外还原型谷胱甘肽的含量(在细胞内：3—10mmol／L；在细胞外：10Ixmol／L)存在巨大差异，因此大量研究是通过制备含双硫键(一s～s一)的刺激响应非病毒基因载体，有效实现DNA在细胞内的解离释放及高效转染⋯’．双硒键(一se—se一)与双硫键相似，在还原剂的作

5、用下发生断裂，但双硒键比双硫键更为敏感，更容易断裂J．Zhang等¨合成了含双硒键的嵌段聚合物PEG—PUSeSe—PEG，并制备出具有还原响应性的载药胶束，结果表明，加入谷胱甘肽后，胶束能缓慢释放出药物．Gu等分别通过含双硫键、双硒键和单硒键的交联剂交联低分子量PEI。。，使阳离子交联聚合物能有效缔合DNA，并有效转染．交联密度与交联聚合物的分子量和伯胺基数量密切相关，因此，本文从PEI。。出发，以丙酸二硒醚为交联剂，通过调节交联剂用量及反应时间，制备了4种双硒交联聚乙烯亚胺(PEISeSe)，研究不同交联程度对DNA

6、缔合能力、质子缓冲能力和转染效率的影响．1实验部分1．1试剂与仪器支化聚乙烯亚胺(PEI。。，分子量为1．8×10，纯度99％)、硒粉(纯度99．9％)、3．氯丙酸(纯度98％)、硼氢化钠(纯度98％)、Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺(NHS，纯度98％)和二环己基碳二亚胺(DCC，纯度收稿日期：2013-O9-22．基金项目：国家自然科学基金(批准号：21074110，51273177)和浙江省科技厅优先主题重点社会发展项目(批准号：2010c3025-2)资助联系人简介：王幽香，女，博士，副教授，主要从事生物医用高分子材料研究．

7、E—mail：yx_wang@zju．edu．cn882高等学校化学学报99％)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；支化聚乙烯亚胺(PEI。。。，分子量为2．5×10，纯度99％)和3一(4，5一二甲基噻唑．2)-2，5．二苯基四氮唑溴盐(MTI'，高级纯)，Aldrich—Sigma公司；鱼精蛋白脱氧核糖核酸(钠盐，高级纯)、Ⅳ-2一羟乙基哌嗪-Ⅳ_2一乙磺酸(Hepes，纯度99％)和Cy3-DNA，生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM高糖培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司；二

8、硫苏糖醇(DTr，纯度98％)，BioBasic公司．美国Mercury．300MHz核磁共振波谱仪(NMR)；英国Malvern公司ZetasizerNanoZS型光散射粒径分布仪；日本NEC公司JEM．1200EX型透射电子显微镜(TEM)；美国Perkin—Elmer公司LS55型荧光光谱仪；美国BectonD