几丁质固定化纤维素酶降解壳聚糖的研究.pdf

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1、第17卷第4期化学反应工程与工艺Vol17No42001年12月ChemicalReactionEngineeringandTechnologyDec2001文章编号:1001-7631(2001D04-0344-05几丁质固定化纤维素酶降解壳聚糖的研究郑连英曾嘉朱江峰(浙江大学生物工程研究所浙江杭州310027D摘要:采用天然高分子聚合物几丁质作载体以戊二醛为交联剂对纤维素酶进行固定化研究了戊二醛浓度~PH值~加酶量对纤维素酶固定化的影响并采用固定化酶反应器对壳聚糖进行降解再通过超滤膜装置进行分离经液相凝胶色谱分析降解产物平均分子量为2900取得了很好的降解效果O同时

2、对该反应器连续运行测定该固定化酶的半衰期为60天且降解性能保持稳定O关键词:几丁质;纤维素酶;固定化;降解;壳聚糖;壳低聚糖中图分类号:X172文献标识码:A1前言几丁质(ChitinD是由乙酰氨基葡萄糖以B-14键连接而成的天然线性高聚物是多种动物外壳的主要成分是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生资源O几丁质分子中约有六分之一的氨基未被酰化双功能试剂如戊二醛等与几丁质及酶蛋白上的氨基均能发生Schiff反应因此可用其来作为固定化酶的载体[1][2]固定化酶具有性能稳定可反复使用产物易分离以及反应终点易控制等优点具有十分广阔的发展前途O目前国内外已有不少研究者应用几丁质

3、作为固定化酶载体如利用几丁质固定枯草杆菌ASl.398中性蛋白酶[3][4][5]等利用大孔交联几丁质固定壳聚糖酶运用几丁质固定乳糖酶几丁质作为酶固定化的载体日益引起研究者的注意O作者也通过对几种不同交联载体进行了酶的固定化试验结果表明几丁质的固定化效果较好因此本文选用几丁质作为酶的固定化载体以戊二醛为交联剂通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上[6]对各种影响酶固定化的因素分别进行了讨论同时将固定化酶装柱制成固定化酶反应器对壳聚糖(ChitoSanD进行降解降解产物再通过超滤膜装置进行分离制得了平均分子量为2900的壳低聚糖(ChitooligoSaccharide

4、SD同时对该反应器的运行性能进行了初步探索O2材料与方法2.1实验材料几丁质:浙江玉环海洋生化有限公司提供O纤维素酶:280U/g本实验室自制O戊二醛:生化试剂25%水溶液上海化学试剂站分装产品O收稿日期:2001-02-15;修订日期:2001-04-18作者简介:郑连英(1947-D女副教授O基金项目:浙江省自然科学基金资助(编号200075D346化学反应工程与工艺2001年壳聚糖:脱乙酰度97.53%粘均分子量29万浙江玉环澳兴甲壳素有限公司O超滤膜:截留分子量5000国家海洋二所提供O2~2主要实验设备仪器乌氏粘度计(毛细管G0.55~0.6mmD;岛津UV-

5、120-02分光光度计;76-1型恒温玻璃水浴;LKB-M型蠕动泵;不锈钢超滤器(G150mmD;固定化酶柱反应器本实验室自制O2~3实验方法2.3.1固定化载体几丁质的精制:将一定量片状几丁质研磨成颗粒状过50目筛用蒸馏水浸泡过夜(室温下D于第二天抽滤加入2mOl/L~Cl浸泡2h至无气泡产生抽滤用蒸馏水冲洗至中性然后加入1mOl/LNaO~煮沸0.5h抽滤用蒸馏水冲洗至中性再加入0.01mOl/LNaO~溶液在50C浸泡1h抽滤用蒸馏水冲洗至中性加入0.01mOl/L醋酸溶液于50C浸泡0.5h抽滤用蒸馏水冲洗至中性80C下鼓风干燥得到精制几丁质O2.3.2纤维素酶

6、溶液的配制:取0.1g280U/g纤维素酶用0.05mOl/L乙酸钠缓冲溶液(p~5.0D溶解定容至100mLO2.3.3纤维素酶的固定化:称取12g几丁质缓慢滴加1.25%的戊二醛60mL搅拌3.5h静置过夜离心去上清液水洗2-3次除去残存的戊二醛抽滤O然后往交联后的几丁质中加入1mg/mL纤维素酶溶液48mL室温搅拌2.5小时后转入冰箱中4C下静置过夜O离心去上清液水洗3次抽滤即得固定化酶O2.3.4壳聚糖的降解:将固定化酶上柱在柱的底部依次放入:滤布石英沙滤布使用蠕动泵将1%的壳聚糖溶液循环过柱每隔4小时取样测定还原糖浓度降解产物再通过超滤器进行分离O2.4分析方

7、法[6]图1固定化酶反应器2.4.1还原糖浓度的测定:采用DNS法O2.4.2酶活力的测定:取5mL培养液离心后取上清液2mLFig1ImmObilizedenzymebiOreactOr1.ImmObilizedenzymecOlumnreactOr(粗酶液D与2mL1%的壳聚糖溶液混合30C下保温30min2.Waterbath3.Peristalticpump然后调节混合液的p~值至8.0离心去除絮状沉淀O取上清液4.Tank1mL加入3mLDNS试剂沸水浴中保持15min冷却至室温后定容至25mL以DNS为空白测定488nm处的吸