微生物学-第八章 微生物与基因工程

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1、第八章微生物与基因工程第一节微生物与基因工程的关系第二节基因工程的基本过程基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工。即把分离的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量的基因产物或者令生物表现出新的性状。其核心是构建重组体DNA技术。简单地说基因工程就是运用重组DNA技术改造生物的性状。基因工程是一种DNA的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再移入原体细胞，使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特性。这种使D

2、NA分子进行重组，再在受体细胞内无性繁殖的技术也被称为分子无性繁殖或分子克隆、重组DNA技术。通过基因工程改造后的菌株被称为“工程菌”。基因工程是一门崭新的生物技术。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并可设计和创建新的蛋白质和新的生物物种。DNA的特异切割、DNA分子克隆、DNA快速测序这三项技术的建立为基因工程奠定了基础。第一节微生物与基因工程的关系微生物与基因工程的关系密切，基因工程的产物和发展依赖于微生物学的理论和技术。微生物在基因工程中的兴起和发展过程中起着不可替代的作

3、用。可以说一切基因工程操作都离不开微生物。①基因工程所用载体不是微生物就是微生物的质粒。②基因工程所用的千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。③微生物细胞是基因工程中基因克隆的宿主，即使是植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物或动物细胞中。微生物和微生物学在基因工程中的重要性④为了大规模表达各种基因产物，从事商业化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或者是酵母菌中以构建工程菌，利用工厂发酵来实现。⑤微生物的多样性，尤

4、其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源。⑥有关基因的结构、性质和表达调控的理论主要是从微生物的研究中取得的，或者是将动物、植物基因转移到微生物中后研究而获得的。一、微生物与克隆载体克隆载体（cloningvector）：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体将其运送到细胞中并进行复制和扩增。这种以扩增外源基因为目的的载体称为克隆载体。把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（vector）。作为克隆载体的条件是：①载体在细胞中必须

5、能够进行独立自主地复制，因此载体应是一个复制子；②载体必须具有若干个限制酶的单一切割位点，便于外源基因的插入。并且这些酶切位点应位于载体复制的非必要去，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍能进行正常的复制。③载体必须具有可供选择的遗传标记。如抗生素的抗性基因等。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6大类：质粒载体；λ噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。载体的选择1）是一个有自我复制能力的复制子（replicon)2)能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率。3）载体

6、上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。4）载体上必须有一种选择遗传标记，以便及时将“工程菌”选择出来。1、质粒克隆载体（1）、质粒载体质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为克隆载体具有十分有利的特性：①具有独立复制起点；②具有较小的相对分子质量，一般不超过15kb；③具有较高拷贝数，使外源DNA得以大量扩增；④易于导入细胞；⑤具有便于选择的标记和具有安全性。2、λ噬菌体克隆载体λ噬菌体克隆载体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：①其分子遗传学

7、背景十分清楚；②载体容量较大，一般质粒载体只能容纳10多个kb，而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段；③具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只有0.1%。但野生型λ噬菌体DNA的分子很大，基因结构复杂，限制酶有很多切点，且这些切点多数位于必需基因之中，因而不适于作为克隆载体，必需经一系列改造才能用作克隆载体。构建λ噬菌体载体克隆载体的基本原则是：①删除基因组中非必需区，使基因组变小，有利于克隆较大的DNA片段；②除去多余的限制位点。3、柯斯质粒载体柯斯质粒载体（

8、cosmidvector）即粘粒载体，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点，其对于将DNA包装成λ噬菌体粒子是必需的。柯斯质粒载体的优点：①具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以