南京农业大学生物化学课件6

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1、第3节核酸的理化性质一物理性质DNA为白色纤维状固体;RNA为白色粉末状固体?1、形态2、溶解性微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNA在溶液中粘度大，RNA粘度小。核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。核酸的理化性质3、两性解离由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低，整个分子相当于多元酸。利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A

2、260来测定核酸的含量。纯的DNA：A260/A280=1.8纯的RNA：A260/A280=2.0二紫外吸收性质A260/A280值可以反映核酸的纯度。核酸的理化性质核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效应(hyperchromiceffect)。增色效应常可用来衡量DNA变性的程度。三核酸的变性核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活性的降低或丧失叫变性。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。1.增色效应核酸的理化性质DNA分子变性(DNAdenaturation)●D.S.DNAS.

3、S.DNA(加温,极端pH,尿素,酰胺)变性过程的表现☆S.S.DNA粘度降低☆S.S.DNA沉降速度加快☆S.S.DNA分子的A260nmUV值上升(Hyperchromicity)热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNA的熔点或熔解温度（Tm）。2.熔解温度核酸的理化性质三核酸的变性热变性曲线(熔解曲线)图5-26Tm的示意图在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。核酸的理化性质1.1851.01.37OD℃Concentration50g/mLD.SDNAA260=1S.SDNAA260

4、=1.37dNTPsA260=1.60Tm=OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)Tm值与DNA的均一性、G-C含量、介质离子强度、pH等因素有关。核酸的理化性质三核酸的变性Marmur-DotyFormulaEvaluationGC%ofDNA1xSSCGC%=3070%(0.15MNacl+0.015MSodiumLimonate)Tm1＜Tm2℃1.01.1851.37ODwhatismeaning?Tm=69.3+0.41×GC%l增色效应的跳跃现象(JumpofHyperchromicity)高分子量的DNA分子在热变性过程中,富含A

5、T区域首先发生变性,然后逐步扩展,表现增色效应的跳跃现象,使变形过程加快.richATrichAT●影响Tm值的因素☆在A,T,C,G随机分布的情况下☆GC%含量相同的情况下GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小AT形成变性核心，变性加快，Tm值小碱基排列对Tm值具有明显影响（除变性核心外）5CG3GCn5GC3CGn5TA3ATn5AT3TAn碱基堆积面和碱基积压程度的差异例：常温下，活体内D.SDNA分子中富含AT的变性核心区（promoter,terminatorregion）常表现氢键的断裂与形成的“DNA呼吸现象”37

6、.6℃57℃Tm＞＞＜＜碱基排列对Tm值具有明显影响☆大片段D.SDNA分子之间比较片段长短对Tm值的影响较小,但与组成和排列相关☆小于100bp的D.SDNA分子比较片段愈短，变性愈快，Tm值愈小☆变性液中含有尿素，酰胺等尿素，酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键Tm值可降至40℃左右☆盐浓度的影响单链DNA主链的磷酸基团负电荷的静电斥力两条单链DNA的分离Na+在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用减弱静电斥力Tm↑当Na+浓度低屏蔽作用小斥力加强Tm↓TmODA260静电斥力0.01M0.1M1.0MNa+当Na+浓度高屏蔽作用大斥

7、力减弱熵值(△S)上升碱基溶解性降低疏水作用力增加pH~12酮基→烯醇基pH~2-3NH2→NH3+(质子化)改变氢键的形成与结合力☆极端pH条件的影响一切减弱氢键，碱基堆积力的因素均将使Tm值降低四核酸的复性1.复性(renaturation)DNA水溶液加热变性时，双螺旋两条链分开；如果缓慢冷即，两条链可以完全重新结合成各原来一样的双股螺旋过程。复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在一定的盐浓度下缓慢降温。核酸的理化性质DNA分子的复性(annealorrenaturation)D.SDNAS.SDNADenaturation▲▼Renatur

8、ation复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞(Dependsonthecollisionofcompleme