种植体骨磨片组织学效果对比 .doc

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1、种植体骨磨片组织学效果对比　　目前，对种植体周围骨愈合和骨结合的研究方法主要采用骨形态计量学分析方法。而种植体与其周围骨组织的结合状态、成骨效果以及骨细胞学研究可通过组织学方法观察、研究和分析。不脱钙种植体骨磨片能完整显示种植体与骨结合的界面和矿化结构，不同磨片染色后，骨组织细微结构显示不同。本实验通过3种不同特殊染色方法进行种植体骨磨片染色，对组织显示效果进行比较分析，探讨种植体骨组织形态学的研究方法，为种植体骨形态计量参数的研究提供依据。　　1材料和方法　　1．1种植体骨组织取材与预处理　　在Beagle犬胫骨植入12枚BLB纯钛圆柱状种植体(北京莱顿生物材料有限公

2、司)，8周后处死动物，制取种植体骨组织标本，将其固定于甲醛溶液48h，酒精逐级脱水，氯仿透明，甲基丙烯酸甲酯与邻苯二甲酸二丁酯混合液浸润、包埋［1］。　　1．2种植体骨磨片的制作　　将修整好的包埋块固定于EXAKT300CP切片机(Leica公司，德国)切取200～300μm厚的切片，然后用EXAKT400CS磨片机(Leica公司，德国)，分别以粒径18μm(800目)、11．5μm(1200目)、5．2μm(2500目)水砂纸将切片磨至10～15μm厚，最后以粒径3．2μm(4000目)水砂纸抛光切片组织表面至完全无磨痕。每个标本制作3张磨片，分别采用3种不同染色方

3、法进行染色。　　1．3配制染色液　　1．3．1亚甲基蓝－酸性品红染色液［2］亚甲基蓝染液包括溶液A和溶液B。溶液A:亚甲基蓝1g，蒸馏水75mL;溶液B:高锰酸钾1．5g，蒸馏水75mL。将溶液A、B混合，100℃水浴至沉淀溶解后冷却至室温过滤。苦味酸酸性品红染液:冰醋酸0．5mL，酸性品红0．25g，甘油10mL，蒸馏水90mL，加苦味酸至饱和。　　1．3．2Goldner’s三色染色液［3］①Weigert’s铁苏木素液由溶液A和溶液B混合而成。溶液A:1g苏木素溶于100mL95%乙醇溶液;溶液B:1．16g三氯化铁、100mL蒸馏水、1mL盐酸混合。②丽春红－酸

4、性品红液:0．4g丽春红、0．1g酸性品红、0．6mL冰醋酸与300mL蒸馏水混合。③磷钨酸－橙黄G液:15g磷钨酸与300mL蒸馏水混合后，加入6g橙黄G混匀。④亮绿液:0．9g亮绿、0．6mL冰醋酸、300mL蒸馏水混合。　　1．3．3甲苯胺蓝染色液①柠檬酸(枸椽酸)磷酸缓冲液由溶液A、B混合而成。溶液A:0．1mol/L柠檬酸溶液，由柠檬酸20．01g加蒸馏水至1000mL配制而成;溶液B:0．2mol/L磷酸氢二钠溶液，由十二水磷酸氢二钠71．6g加蒸馏水至100mL配制而成;取溶液A32．3mL、溶液B17．7mL，混合即成pH值为3．8的缓冲液。②甲苯胺蓝液

5、:甲苯胺蓝2．0g溶于100mL缓冲液，溶解后过滤，用1mol/LNaOH调pH值至3．8。　　1．4磨片染色　　1．4．1亚甲基蓝－酸性品红染色法［4］将磨片置于亚甲基蓝染液染色，60℃水浴15min，滤纸吸干染液;60℃蒸溜水漂洗，干燥;酸性品红染液染色5min，滤纸吸干染液;95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片。　　1．4．2Goldner’s三色法［4］将磨片脱塑至水，Weigert’s铁苏木素液15min，蒸溜水漂洗1次，流水冲洗15min，蒸馏水漂洗1次，丽春红－酸性品红液15min，1%醋酸液漂洗2次，磷钨酸－桔黄G液8min，1%醋酸液漂洗2次

6、，亮绿液15min，1%醋酸液漂洗2次，70%乙醇漂洗1次，100%乙醇漂洗2次，二甲苯透明，树脂封片。　　1．4．3甲苯胺蓝染色法将磨片脱塑至水，甲苯胺蓝染色液10min，柠檬酸(枸椽酸)磷酸缓冲液冲洗2次，1min/次，吸干磨片水分，乙醇脱水2次，1min/次，二甲苯透明2次，1min/次，树脂封片。　　1．5组织学观察　　将3种特殊染色法染色后的磨片置于倒置相差显微镜下，观察并采集图像。　　2结果　　2．1亚甲基蓝－酸性品红染色法　　亚甲基蓝－酸性品红染色后种植体骨结合界面清晰，种植体表面羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂层为紫红色，成骨细胞及细胞

7、核、类骨质显示清晰，成骨细胞核染成深蓝色，细胞基质染成淡蓝色，类骨质为紫灰色。新骨组织为深红色，与种植体骨界面分界清晰，原矿化骨组织为红色，与新生骨分界较模糊(图1A)。　　2．2Goldner’s三色法　　Goldner’s三色法染色后种植体骨结合界面清晰，种植体表面HA涂层为亮绿色，新生骨为深绿色，原矿化骨为绿色，二者界限清楚，成骨细胞为橘黄色，着色浅，不能分辨细胞核及其基质，类骨质染成橘红色，成骨细胞与类骨质分界模糊(图1B)。　　2．3甲苯胺蓝染色法　　甲苯胺蓝染色显示种植体骨结合界面较模糊，种植体表面HA涂层为蓝紫色，新生骨为深