细胞生物学实验-叶绿体和线粒体的分离

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1、叶绿体和线粒体的分离及活体染色叶绿体外膜内膜基质类囊体类囊体基质膜间隙基粒类囊体叶绿体是植物细胞所特有的能量转换器，光合作用就是在叶绿体中进行的，所以在细胞生物学、遗传学、分子生物学中都有很重要的研究地位。叶绿体由叶绿体外被、类囊体和基质三部分组成，叶绿体含有三种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。线粒体内膜外膜嵴基质线粒体作为细胞的动力工厂，是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有三羧酸循环所需的全部酶

2、类，内膜上含有呼吸链酶系及ATP酶复合体。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验目的：1.了解细胞器分离的原理和常用方法2.了解细胞器活体染色的原理和常用方法3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用实验器材：新鲜的菠菜叶、冷冻离心机、荧光显微镜、普通光学显微镜、纱布、烧杯、胶头滴管、载玻片、盖玻片、刀片、研钵0.35M氯化钠溶液、0.01％吖啶橙（AcridineOrange）小白鼠肝脏、解剖刀剪、冰浴装置、吸管、玻璃匀浆器、冷冻离心机、培养皿匀浆介质I（0.25M蔗糖；0.035MEDTA；0.05MTris-HCl，

3、pH=7.4）、匀浆介质II（0.21M甘露醇；0.07M蔗糖；0.005MTris-HCl，pH=7.4；0.001MEDTA）、0.02%詹纳斯绿（JanusGreenB）in0.25M蔗糖、70％酒精叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：1、差速离心（适用于不同沉降速度的颗粒分批分离）采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法。一个颗粒在一个固定离心力的作用下的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同悬浮颗粒介质的粘稠度有关。当以一定离心力在一定的离心时

4、间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含较小和较轻颗粒的“上清液”，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心（2—3次），才能得到较纯颗粒。差速离心方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其它分离手段之前的粗制品提取（如细胞和病毒的分离等）。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：2、密度梯度离心（适用于沉降系数较接近的物质分离的方法）不同颗粒之间存在沉

5、降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的介质为蔗糖、甘油等。密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：3、等密度离心当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密

6、度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离；离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。等密度离心常用介质为氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。介质溶液与样品液混合均匀，离心足够长的时间。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：活体染色是指用染料标记生活有机体的细

7、胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下细胞的形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内

8、某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，