核酸提取及琼脂糖电泳

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1、核酸提取及琼脂糖电泳核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。DNA提取的几种方法染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通

2、过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。基因组DNA－CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HClEDTA组份（pH8.0（pH8.0NaClCTABβ-巯基乙醇））0.1%终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，

3、抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方Tris-HClEDTA组份（pH8.0（pH8.0NaClCTABPVP40β-巯基乙醇））2%（V/V）终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚

4、的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB法流程图植物材料裂解液酒精沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解基因组DNA－SDS法SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法DNA提取缓冲液Tris-HClEDTA组份（pH8.0

5、（pHNaClSDS）8.0）终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织抽提离心洗涤组织匀浆上层溶液干燥溶解DNA溶液细胞裂解酒精沉淀基因组DNA－其它方法根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：•硅质材料高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。•阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。•磁

6、珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。基因组DNA－其它方法浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备基因组DNA的提取最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组

7、DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集细胞裂解基因组DNA的提取材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：•植物材料－－液氮研磨•动物组织－－匀浆或液氮研磨•组培细胞－－蛋白酶K•细菌－－溶菌酶破壁•酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡核酸分离、纯化基因组DNA的提取采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时

8、应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离、纯化多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除