猪小肠肠粘膜浆膜肠衣中的粘多糖组成分析

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1、万方数据亿亏与耋物Z程2012。V01．29No．4Chemistry&Bioengineeringdoi：lO．3969／j．issn．1672—5425．2012．04．026分圻囊试田猪小肠肠粘膜／浆膜／肠衣中的粘多糖组成分析高照明。曹现平。张迎迎。张玉冰(青岛科技大学化学与分子工程学院，山东青岛266042)摘要：为了确定污染肝素纳中污染物多硫酸软骨素的来源。将肝素钠的主要原料猪小肠分离为肠粘膜、浆膜、肠袁．采用酶解法提取其中的粘多糖成分．并采用。HNMR时提取的粘多搪进行定性、定量分析。结果表明，肠拈膜的粘多糖主要成分为肝素钠，并舍有硫酸皮肤素和

2、硫酸软骨素C；蒙膜中肝素钠和硫酸皮肤素的舍量相当。并舍有少量硫酸软骨素C；肠衣的粘多糖主要成分为硫酸皮肤素，并含有肝素钠、硫酸软骨素A及硫酸软骨素c；肠粘膜、浆膜，肠衣均不舍多硫酸软骨素。关键词：粘多糖；肠粘膜；菜膜i肠表；1HNMR中图分类号：TQ464．1文献标识码：A文章编号：1672—5425(2012)04--0091—042008年初，美国及欧洲等12个国家发生了严重的肝素钠注射液不良反应事件口]，数百例病人出现过敏反应。表面皮肤水肿，心跳过快，血压过低，恶心呕吐L2]。约百例病人死亡口]。自美国FDA应用1HNMR和CE查出此批肝素钠(Hep

3、arinsodium，HP)原料中存在类肝素钠杂质——多硫酸软骨素(Oversulfatedehondroitinsulfate，OSCS)[2]，可能为引起病人不良过敏反应的异常杂质H1之后，在数批肝素钠及低分子肝素钠中均发现了OSCScq。究竟OSCS是否为致命的罪魁祸首，各国专家从分子结构、药理、临床、来源等方面对其进行了论证【2~引。Kishimoto等[73证实OSCS是引发过敏反应的污染物，其在血浆中激活激肽释放酶产生缓激肽，诱发了过敏毒素的产生。Zhang等口]证实杂质硫酸皮肤素(Dermatansulfate。DS)、硫酸软骨素(Chond

4、roitinsulfates，CS)无毒。而OSCS有毒，可能是导致百例病人死亡的原因。关于OSCS的来源引起了各国科学家的纷争：Guerrini等[z]认为OSCS不是天然存在的，而是人工合成的；Pan等n]指出肝素钠事件中，OSCS并不是未分级肝素钠中唯一的污染物，与人工合成OSCS相比，OSCS更可能来源于多硫酸化的糖胺聚糖废料；Keire等[93认为OSCS是人工半合成的，是人为添加到肝素钠中的。作者在此从肝素钠的来源——猪小肠着手。将猪小肠分离为肠粘膜、浆膜、肠衣三部分并分别酶解提取其中的粘多糖，进而对粘多糖成分进行分析，以期对OSCS的来源进行

5、深入研究。l实验1．1．材料、试剂与仪器新鲜猪小肠购于青岛李沧西流庄市场。胰蛋白酶、D-254树脂，青岛九龙生物医药有限公司；重水(D20)，氘代度99．8％，CIL公司；三甲基硅丙磺酸钠(TSP)，氘代度98％，Sigma公司；NaCl、HCl、乙醇，分析纯，青岛正业化学试剂厂。BrukerAV500型核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司。1．2肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖的提取将新鲜猪小肠洗净，用竹刀轻刮出肠粘膜并收集；再将猪小肠最外层的浆膜剥离并收集；剩余部分即为肠衣。将肠粘膜／浆膜／肠衣投入反应锅，按其质量的5％加入胰蛋白酶，用3mol·L-1的Na

6、OH溶液调pH值为8～9，同时搅拌升温至40℃左右，维持2．5h；再升温至60℃，按肠粘膜／浆膜／肠衣质量的2％加入NaCI，升温至90℃，调pH值为6～7，加热至沸腾，保持10min，趁热用200目尼龙筛过滤；待滤液冷却至60℃左右，用3mo!·L叫的NaOH溶液调pH值收稿日期：2011—12—22作者简介：高熙明(1987一)，男，山东格沂人。项士研完生·研完方向：生物医药化学与分析化学，E-mail：jngaozhaoming(西128，com；通讯作者：张玉冰，剐教授，E-mail：yubingzh@126．Corn。盈署————————————

7、——————————一高照明等：猪小肠肠粘膜／浆膜／肠衣中的粘多糖组成分析／2012年一4_万方数据为8～9，按滤液量的5％加入D254树脂，搅拌吸附6h，静置1h(吸附过程保持pH值为8～9)，过200目尼龙筛；在树脂中加入等体积自来水漂洗数次，用pH值为10的3tool·L_1NaCl溶液搅拌洗脱树脂2h(NaCI溶液用量与树脂量相等)；过200目尼龙筛，收集滤液；重复洗脱2次，合并滤液；在滤液中加入等体积乙醇。搅拌10rain，静置12h以上；收集下层沉淀物，用乙醇脱水3次；将沉淀物置60℃烘箱中烘干，得粘多糖。1．3分析检测采用1HNMR对提取的粘

8、多糖进行定性、定量分析。1H的共振频率为500．03MHz；脉冲序