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《dtnb与蛋白质巯基的相互作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、1983年河北大学学报(自然科学版)第2期DTNB与蛋白质’疏基的相互作用张光兴《分子生物学研究室)提要本文讨论了DTNB与蛋白质琉墓相互作用的反应机理;概述了近年来对TNBA(CNT),对若下性质的最新认识作为一种试剂用来测定蛋白质中的游离琉基或潜在琉墓方法的可靠。性的某些问题也作了探讨reesurylgroupsotentia许多天然蛋白质中含有游离疏基(flfhyd)或潜在的(pl)。,rous琉基在蛋白质中琉基往往以活性功能基(functionalgp)的形式参与酶的催化或。参与辅助因子的结合或参与蛋白质活性构象的维持研究蛋白质琉基的数量和性质是近代生
2、。物化学和分子生物学获得某些结构信息(5truot盯aliuformation)的重要手段之一现,es今已知用来作用蛋白质琉基的试剂大约有60多种有各种二硫代物(disulfid)被用来测,an’).,定蛋白质琉基‘其中EUm试剂(DTNB)是蛋白质琉基最为专一的试剂也是公认、。地最广泛地用来测定琉基的试剂一。反应机理’DTNB与蛋白质琉基相互作用形成有色的硫酚阴离子(CNT)或称5一硫代一2一硝.基苯甲酸(盐)朔离子(TNBA)和混合的二硫代物(mixeddisulfidos)5一硫代一2一,).:硝基苯甲酸(盐)蛋白(TNBP)--/COO/COOZ<,S
3、一《二)一NOS仁少一NOPS-十~)一(Tl-NBA)(A)S2一(多一N0-P一S一S一NO:eoo《身一-eoo(琉基蛋白质)(DTNB)(TNBP)iop”“e“nio”)的,TNBA杨蔡个共振稳定的硫酚盐阴离子(thhelat存在上述反应,2。,an.的平衡趋于右侧(K平、1425℃)》因此在有稍微过量的Ellm试剂存在下(PHS0或8.1),、有色的硫酚阴离子形成。这样,上渗反应实际上是不可逆的并有大量的作为该反.,此文曾彝钾83年1。月成都举行的第一次全国工业生化学术会议卜宜读过尽尽应琉基数的一种测量,可用分光光度法进行测定。..,创loan
4、试剂通常是溶解在pH8o的磷酸盐缓冲液或Tr:5缓冲液中使用的具浓度为10mM(o.01M),DTNB可以添加lmM的EDTA‘.相当子片一10倍的疏基数的蛋到含有。,白质溶液中(EDTA在反应混合物中的作用不只是保护疏基不致氧化而且也是为了防止。某些金属离子影响颜色的进展),:DrNB作为测定蛋白质琉基的一个有用的试剂上述反应有如下特点”1)DTNB和outy。2)反一:so。亡。:poeeity),TNB人在水中的可溶性(Slbsli)应的绝对专侧Ablf[i3)(aaptay).4)(Serlsitiv使用比色测量的适用性dbilit反应的灵敏性ity)
5、和5)反应。的准硫性(aecuracy),山71年尺。bDTNB与蛋白质疏基和二硫基相互作用的反应机理J’.yt完整地提出了pHS.l/-CoO·+-(l)P一S,P一S一5一一NO:一一仁〕十ZS一仁》一NO-eoo卜一厂、一·一,(2)F一5一+,一Z-S尸仁少一NOPSS一仁》一NOP一Sc00一coo-/C(〕-。一-NOZ/CO。产仁少’“’P一5p一g一只一)一NO:心仁;(B)》:一<一Nu多--十才eooS一仁少一NO-c00.十DTT生-:--吧(4”P一只一三仁少一NO一一,3P一S十八OS)付O.仁-coo—pHzo5七0
6、0:上述反应的总反应式为-/COO‘5,P一SP一s一s一。十2一仁少一N。?只p只一1丢b一2S一屯屯乡N0长-盘eoo但是,许多工作者都认为,蛋白质的兢基部分与ma。,En试剂反应以后剩余的疏基可:能参与以下两个竞争的反应之一一,第它们可能与剩余的Elman试剂按照反应式(B)一(1)继续进行,在有利的空间条件下,它们以混合二硫代物一TNB一蛋白的形式进行快速地分、NBA:子内反应释放出硫酚阴离子门)并同时形成新的蛋白质二硫代物,SP一S一S一NOp/l+SNO:(C)仁》一一‘一趁叠一-一亏-}COOCOO-S上述的分子内反应已在许多蛋白质中观测
7、到。‘,’.)’。,、二TNBA(CNT)的某些性质:,〔一)共振稳定性上述反应所生成的硫酚阴离子其硫原子上的电荷在阴离子与酮式结构之间通过共振转移(resonanttransition)而稳定化:一/-CoO/COOS::-一仁)一NOS一仁>一NO一..。该阴离子在25℃和01离子强度下的PKsH值为44,,(。:、,二)摩尔消光系数()每一个蛋白质疏基无论是参与反应(A)(B)一(4)。还是反应(C)都能释放出等当量的TNBA黄颜色的TNBA阴离子在412nm波长处有最大,一。oan325n。=15,oooM一’e一’8)吸收值而Ell试剂本身的最大吸收
8、波长在m(m)关于TNBA。,,,一‘
