2013-阅读-蛋白质标签

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1、蛋白质标签中国农业大学齐孟文蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的某些抗原表位的多肽、结构域或蛋白，以便于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。标签通过与与配体作用而被赋予不同的功能，配体一般包含一个连接集团，用于和标签发生亲和作用或共价结合，同时还含有一个功能集团，功能集团常为亲和集团、荧光和染料分子、光控灭活集团等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。MediumLigandTagCleavageRecombinantBeadSite

2、Protein图1.蛋白质亲和标签作用过程示意图。1.用以纯化、检测的亲和标签融合标签的作用主要是用于目的蛋白的检测和纯化，有时也用来增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的表达产量。根据用途，融合标签一般有两种选择，一种是多肽小标签，其一般不影响融合蛋白的三级结构及生物活性，在某些应用时，无需去除，如因不具免疫源性，融合蛋白可直接用于抗体生产;另一种是以大的肽或蛋白质作为融合担体，通过影响蛋白质的折叠，以提高其溶解性，缺点是对于结晶或抗体生产，标签必须被去除。常用的亲和标签见表1,亲和纯化系统见表2。表1.常用亲和标签的序列和大小标签残基序列

3、大小（KDa）Plog-His通常6HHHHHH0.80个FLAG8DYKDDDDK1.01c-myc11EQKLISEEDL1.20Strep-ta8WSHPQFEK1.06gⅡSPB38MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQRE4.03PGST(谷胱211蛋白质26.00甘肽疏基转移酶)MBP(麦芽396蛋白质40.00糖结合蛋白)纤维素结27-18结构域3.00-20.0合结构域90壳聚糖结51结构域5.59合结构域表2.标签融合蛋白亲和洗脱系统亲和标签亲和基质洗脱条件2+2+Plog-HisNi-NIA,Co-CMA(Talon)150mM咪

4、唑或低pHFLAGAnti-FLAG单抗pH3.0或2-5mMEDTAc-myc单抗低pHStrepStrep-Tactin(修饰的链球菌2.5mM脱硫生物素抗生物素蛋白GST谷胱甘肽5-10mM还原型谷胱甘肽SPBStreptavidin（链球菌抗生物2mM生物素素蛋白MBP交联淀粉麦芽糖纤维素结合纤维素盐酸胍或大于4M尿素结构域壳聚糖结合壳聚糖内含子融合：30-50mM二结构域硫苏糖醇，或半胱氨酸应用举例1）融合标签蛋白的纯化如组His-标签蛋白的亲和层析分离纯化，采用两步可得到高纯度的组氨酸标签蛋白，过程见图2.;FLAG-标签蛋白免疫沉淀分离纯化，见图3。图2.His-标签

5、蛋白的亲和层析分离纯化。来自WWW.gelifesciences.com.cn图3.FLAG-标签蛋白的免疫沉淀分离纯化。来自，http://www.cellmigration.org/resource/proteomics/images/flagpurifn.png2.用以介导探针标记的修饰标签蛋白质标记探针技术是研究功能蛋白质组学的基本方法，可实时测定或可视化活体细胞中蛋白质的表达、定位、贩运、代谢及相互作用过程。为了有效化对蛋白质进行小分子探针的标记，常利用遗传修饰的方法，在融合蛋白上引入诸如多肽、修饰酶蛋白的修饰标签，以介导小分子荧光或燃料探针的标记。在此，主要介绍基于标签

6、介导的共价键结合的标记技术，基于标签的蛋白质标记的方法一般应具有以下特点:1)选择的标记均可一步引入；2)标记快且定量；3)非靶蛋白不被标记；4）标签尺度小以减小对蛋白功能的影响；5）标记试剂没有副作用。除此之外，标签应可以在活体、复合蛋白质样品、细胞表面、细胞内或细胞隔室工作。以上条件实现的难度是顺序加大的，实际上不可能都能满足，现在存在的标记方法各有优缺点，大体可分为3类：自标记标签、自标记蛋白，以及酶介导的标签标记，见图4。图4.标签介导的蛋白质标记家族。自标签标签，上面：蛋白上的融合标签直接和标记无反应，专一性由反应官能团间空间排列相容性决定；下面：含有标记和识别元件的双官

7、能团的化合物先与标签非共价结合，然后由蛋白质的氨基酸侧链的邻域作用转变成共价结合,同时释放出识别元件。自标记蛋白，标记化合物含有标记和介导与蛋白质共价结合反应的官能团。酶介导标签标记，标记由专一识别标签的转移酶完成，标记化合物同时含有标记和酶所识别的化学官能团。E-亲电集团，R-酶所识别的集团。图片来自，www.sciencedirect.com现有的自标记标签和蛋白系统见表3。其代表性的标记系统简述如下：2.1自标记标签家族òtetracysteine-biarse