实验3植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察.ppt

《实验3植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验四植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察CollegeofLifeScienceandTechnology,XINJIANGUnivercity一、实验目的初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器的方法；掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法；掌握分离的细胞的活性鉴别方法；熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿体的形态大小。二、实验原理细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。细胞核是植物

2、细胞中最大、最重要的细胞器，使细胞各种生命活动的指挥中心。叶绿体是植物细胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细胞器。由于它们的重要功能，所以它们一直是细胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对象。利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和叶绿体。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使非

3、均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液，它与细胞质的分散相接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性。二、实验原理三、实验用具和试剂1．仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯、量筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。2．试剂：①SNT溶液：0.4M蔗糖、0.01MNaCl

4、②0.05MTris-HCL缓冲液：0.2MTris（三羟甲基氨基甲烷）50ml0.1NHCL50-55ml两液混匀后，加蒸馏水至200ml，pH7.6③1/3000中性红染液:称取0.5中性红溶于50mlRinger溶液，稍加热（30~400C）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。④香柏油3．材料：新鲜菠菜三、实验用具和试剂四、实验内容1．组织匀浆液的制备（组织捣碎法）

5、。2．细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分离、纯化（离心分离法）。3．细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、大小、分布位置、数量识别法）。4．分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色法）。五、实验方法和步骤1．取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。2．匀浆：将称取60g叶片小块放入组织捣碎机套筒内，加入200mlSNT溶液，匀浆20秒(最高速度)制成匀浆液。3．过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或400目尼龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。4．离心：滤液↓200×g（100

6、0rpm/分）1分________________________↓↓沉淀1上清,平衡,离心（含叶肉细胞）↓500×g（1500rpm/分）1分↓↓沉淀2（含细胞核）上清,平衡,离心↓1000×g（3000rpm/分）5分↓↓沉淀3上清，弃（含大量叶绿体）5．悬浮：分别收集沉淀，用少量的SNT溶液分别将沉淀1、2、3悬浮。6．镜检：①取悬浮液1、2分别做滴片镜检。然后加几滴中性红染色5-10min，盖上盖玻片镜检。②取悬浮液3做滴片盖上盖玻片，用油镜观察。六、实验结果1．在普通光学显微镜下，在悬浮液1

7、滴片中可以看到含细胞核和大量叶绿体的叶肉细胞（形态为球形或椭圆形的原生质体）。2．在普通光学显微镜下，在悬浮液2滴片中可以看到细胞核（形态为球形）。3．在普通光学下，在悬浮液1、2滴片中性红染色可以鉴别活细胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂，在细胞处于生活状态时，中性红只将液泡染成红色，而细胞质及细胞核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。4．在普通光学显微镜下，在悬浮液3滴片中可以看到叶绿体（叶绿体为绿色椭圆形，在高倍镜下可以看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒）。七、实验注

8、意事项1．细胞和各种细胞器的分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压的改变使细胞和细胞器的受到损伤。2．要注意整个实验的分离过程必须在0～5℃的条件下进行，避免酶的失活；如果在室温下，要迅速分离和观察。3．离心过程中要注意离心力和离心时间。得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注意的问题？八、实验作业1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体）。2.得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注意哪些问题？谈谈SNT溶液中的各种成分的作用。3