dns法测定α-淀粉酶活力的方法

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1、利用DNS法测定α-淀粉酶活力的方法目的要求了解生物学研究中针对糖含量测定的常用方法及相关原理。掌握一般标准曲线制作的意义及要求。掌握DNS比色法测定α-淀粉酶活力的原理、方法及操作步骤。掌握利用EXCEL分析工具库数据分析——回归分析，得到回归方程及相关分析结果。糖的测定方法大致可分为三类：1.物理法——旋光法、折光法、比重法；2.物理化学法——点位法、极普法、光度法、色谱法；3.化学方法——斐林氏法、高锰酸钾法、碘量法、铁氰化钾法、DNS比色法、蒽酮比色法、咔唑比色法生物学研究中关于糖测定中常用的方法菲林试剂滴定—

2、—还原糖，常量分析DNS比色法——还原糖，微量分析蒽酮比色法——总糖，微量分析配制系列浓度稀释液的方法线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀释（1、1/10、1/100、1/1000……）；调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4，1/5……）。α-淀粉酶酶活力测定的原理底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反应一定量

3、淀粉为糊精的时间）产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如DNS法），从而计算出酶活力单位。DNS试剂测定还原糖的原理淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。酶活力测定（DNS比色法）酶活力定义：在一定反应条件下（本实验

4、为40℃，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。注意：去除β-淀粉酶的干扰（β-淀粉酶不热耐，在70℃15min钝化）——植物材料来源需要注意。本此实验中忽略不计。检测的原理：酶解的产物之一——麦芽糖具有还原性，可以使试剂中的3，5-二硝基水杨酸还原，形成红色的物质，在540nm下有吸收峰，并和浓度呈一定线性关系。计算公式：根据标准曲线计算。3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明21g氢氧化钠（先加入溶解）；182g酒石酸钾钠（同上）；6.3gDNS（3，5-二硝基水杨酸），

5、加热完全溶于上述溶液中；5g重蒸苯酚（冷却后加入）；5g无水亚硫酸钠（冷却后加入）；完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。引自：朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，袁厚积编著．生物化学实验．上海：上海科学技术出版社，1981．标准曲线法取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为λmax），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（OD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲线（工作曲线）。理想的标准曲线满足以下条件：1、至少5个点，一般不超过7个点；2、2个以

6、上重复值；3、重复值误差小于5%；4、点与线的垂直距总和最小；注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测定范围）理想标准曲线的特点过原点的直线；斜率为1（45°）；浓度为待测物质浓度的一半～二倍；OD值在0.05～0.8之间（最好控制在0.2～0.6）。mg/ml麦芽糖标准曲线的制作取6支干净的具塞刻度25mL比色管，编号，按下表中加入相关试剂；混匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量（mg）为横坐标，吸光度（OD）为纵坐

7、标，绘制标准曲线。——沸水浴时不要加塞！利用Excel中相关统计分析工具，完成回归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。相关试剂（第一种）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）5.78g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）21.32g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉（105℃烘干2hr）溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中（一般需要

8、密封121.3℃灭菌处理20min）。相关试剂（第二种）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。0.2mol/LpH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O7·H2O）7.74g，先在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量