用1.8μm反相(rp)色谱柱进行快速氨基酸分析(aaa) 安捷伦5989-6297chcn

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1、用1.8µm反相(RP)色谱柱进行快速氨基酸分析(AAA)应用制药与食品作者引言CliffWoodwardandJohnW.HendersonJr.氨基酸的检测和定量分析一直是蛋白质和食品分析的安捷伦科技公司重要部分，1951年Moore和Stein研制出了第一台氨2850CentervilleRoad基酸分析仪，将未衍生的氨基酸(AAs)用离子交换色谱Wilmington,DE19808分离后，用茚三酮进行柱后衍生，在可见区检测[5]。USA1958年由Beckman开发并推出了全自动分析仪。它Tod

2、dWielgos成为蛋白质分析的里程碑，并在1972年诺贝尔化学BaxterHealthcareCorp.奖核糖核酸酶的研究中发挥了重要作用。以前需要几RoundLake,IL60073周完成的分析，用该方法不到1天就可以完成。USABeckman新一代的氨基酸分析仪已将分析时间缩短到大约110分钟，但用茚三酮灵敏度仍然有问题。摘要用邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇进行柱后衍生反应有氨基酸分析(AAA)常被用作蛋白质组学和食品质量检测中测定一些可能，但却只能检测一级氨基酸（见图1a）。样品中氨基酸(AA)

3、准确组成的工具。为了及时分析样品，需要1971年首次报道了用OPA对氨基酸进行柱前衍生[6]。分析周期短；为了测定有限量的样品需要高灵敏度的方法；为衍生物相当不稳定，但这一过程可以实现自动化。了提高实验室效率，需要自动化的方法。本文报道了用新开发灵敏度得到了提高，特别是使用荧光检测(FLD)时。的1.8µm粒径色谱柱测定氨基酸的新方法。这种专利的填料OPA不发荧光，其衍生物有很强的荧光，但二级氨基经过专门设计，其产生的反压比市场上任何其它亚2微米填料酸仍不能检测。另一种衍生化试剂氯甲酸9-芴基甲酯都小，

4、可以在400barHPLC系统以及耐压更高的仪器上使用。(FMOC)和一级、二级氨基酸都能反应生成稳定的衍我们采用惠普/安捷伦公司1988年首次推出的OPA/FMOC化生物，但其本身却具有很强的UV吸收和荧光（见图学衍生法，并改善了以前方法的精密度、分析时间、柱寿命1b）[7]。衍生反应结束后还需要进行提取或与疏水和耐用性[1-4]。性很强的胺进行反应，以除去过量的FMOC和反应副产物[8]。这种方法也可以作为自动化柱前衍生方法[9]，但商品化时存在问题，与没有使用反提取的系统相比，为了使其在商业上可行

5、，需要进行一些化学上的改进：相对标准偏差(RSD)较高。将硫醇换成3-巯基丙酸(MPA)使OPA衍生物更稳定；所有一级氨基酸先与OPA反应，将一级氨基酸从下一1986年惠普/安捷伦将这两种化学反应依次结合，不步的反应中定量除去；然后加入FMOC，FMOC只与用反提取实现了蛋白质水解液氨基酸的全自动衍生、二级氨基酸反应。由于FMOC、FMOC衍生物和反应色谱分离、检测和报告[1]。1988年开发并销售了商副产物比任何OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不品化的分析仪，总分析时间只有36分钟，灵敏度达会干扰任

6、何一级氨基酸的检测。因为只有几种FMOC到飞摩尔水平。这对于生物技术公司和大学的研究人衍生物，所以可以使用简单的两段梯度将这些氨基酸员来说，无疑是迈向正确方向的一步，因为他们的样与反应副产物和FMOC分离[1]。详见图1和图2。相品非常有限，尤其是在药物研发的早期阶段。应于各个色谱峰的化合物名称见表1。a)OPAOSR’H+R’SH+RNHNR2H๪࿒Oݥᆑ࠼๬वLjሞ230nmᆑ࠼X>Ex230nm,Em450nmᆶဌ๭Lj338nm࿮ဌ๭DAD:338,10nm;Բ390,20nm230nmࢅ338nm

7、਩ᆶဌ๭b)FMOCRR’NH_HCl+or๪࿒RNH2ONRR’OClorOONHRᆑ࠼๬वLjሞ266nmᆑ࠼X>Ex266nm,Em305nmᆶဌ๭Lj305nmᆶᆑ࠼DAD:262,16nm;Բ324,8nm图1.邻苯二甲醛(OPA)与氯甲酸9-芴基甲酯(FMOC)与胺的反应2*FMOC>तޭ࿿*๬वই঴ރ2215123520918107111316414196171821223**ᅃपҽए໗>(OPA)ܾपҽए໗(FMOC)123456min图2.用快速分离高通量EclipsePlusC18柱(4

8、.6x50mm，1.8-µm)进行氨基酸分析：DAD检测。柱上浓度为125pMoles表1.OPA和FMOC氨基酸衍生物的名称和洗脱顺序实验部分峰号氨基酸名称氨基酸缩写衍生物类型仪器1天门冬氨酸ASPOPA2谷氨酸GLUOPA本文中的结果都是在Agilent1200SLHPLC系统上测3天门冬酰胺ASNOPA定得到的，该系统包含以下组件：4丝氨酸SEROPA5谷氨酰胺GLNOPAG1312B，SL型二元泵6组氨酸HISOPA7甘氨酸GLYO