一种细胞培养微芯片的制作及应用

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1、万方数据万方数据1254ISSNl000-3061CNll-1998，QChinJBiotechJuIy25，2008VoI．24№．7细胞培养腔体内的微结构阵列【6】或者是利用微流体层流性质形成的细胞凝胶结构【7】等方法可实现细胞的立体培养。建立细胞研究的基础平台，结合芯片内微流体形成的化学物质的浓度梯度，精细控制细胞外基质，建立浓度依赖的分析方法【8'9J，实现细胞响应的高通量检测；微流体产生的剪切力施加于细胞，可模拟其在体内环境的受力情况，可使细胞的活性较常规培养有很大提高【lo】，为利用微芯片进行组织研究

2、奠定良好基础。微流体器件集成性能优良，在细胞培养芯片内可以集成微阀fll】等器件，实现培养基以及刺激液的自动进样，可以建立细胞分析的o1sc盛墓篆嚣怒hjp自动化平台。因此，细胞微系统平台已经成为目前细(a)stnlct哦sof孟echjp；(b)diagram毒tIlecross．s三ctionalvi唧of胞生物学领域和微流体芯片领域的热点研究方向。也e皿。僦h加嘲本文将微流体技术与细胞培养技术相结合，介绍了一种基于微系统平台控制细胞分布进行细胞培养的方法，该微系统芯片不需要借助于凝胶等介质以及对微流体流速的

3、精确控制，只利用微通道之间的狭缝。能够有效的控制细胞的分布区域，实现培养区域的相对独立，而小分子的培养基和药物成分可以自由流动通过，实现了长时间的细胞培养。同时在该平台上可以对细胞状态进行实时观测，为药物筛选等提供了一个全新的细胞培养和筛选平台。1实验方法1．1芯片制作本实验中制作如图1(a)所示的细胞培养微芯片，其中b孔为细胞悬浊液进样孔，细胞培养通道的宽度为100“m，a孔和c孔为培养基或者刺激液进样孔，其管道宽度为200岫，该芯片的主要特点是如图l(b)所示的粗黑线处的通道高度仅为5岫的狭缝，该狭缝既可保证

4、细胞培养区与微管道区的连通，又可以使这两个区域相对独立，保证细胞在固定的区域生长，而培养基和刺激液等小分子可以自由流通。该细胞培养微芯片制作的基本方法是先通过微加工技术在硅片表面制作出双层的SU．8负性光刻胶模具，然后通过模塑方法形成具有微结构的PDMS基片，最后与玻璃键合形成封闭的通道网络，用于细胞的培养和研究，其制作的工艺流程图如图2所示。芯片制作的关键工艺是通过制作双层的SU．8负性光刻胶模具形成狭缝，下面详细介绍芯片制作的工艺过程。JOumab．im．扯．cn图2芯片制作流程示意图彤g．2SchemaHc

5、m哪tranonofp瞅edu件tohbri∞temecmp首先是利用SU．8负性光刻胶进行“多次光刻、一次显影”【121工艺制作双层的细胞芯片模具。将硅片在Pi珊nha洗液(硫酸和双氧水按5：1混合)中煮沸10ⅡIin，冷却后用去离子水冲洗干净，氮气吹干后在2000C烘箱中烘30min。在清洗干净并烘干的硅片上甩涂稀释的负性光刻胶SU8．2025(MicroChemCorp．，MA，USA)，放在热板上在650C烘1nlin然后升温至950C保持2min，缓慢降温至室温。在光刻机中将第一层掩模版与硅片对准，曝光

6、，然后对基片进行PEB(Postexposedba】(e，PEB)，即在热板上650c烘1ⅡIin然后升温到950C保持1min，缓慢降万方数据邵建波等：一种细胞培养微芯片的制作及应用1255温至室温，这样就将第一层的图形转移到SU．8光刻胶上。再将第二层SU8—2025甩涂于基片表面，在热板上加热到650C保持1min然后加热到950C保持3nlin冷却至室温完成前烘，对准第二层掩模曝光。将硅片放到热板上加热到650C保持lIIlin然后升温至950C保持3min完成PEB，缓慢冷却至室温。最后超声辅助显影，形

7、成双层的SU．8模具。将PDMs(DowComiIlg，Michig觚，USA)单体与固化剂按照10：1的比例混合均匀后，抽真空后进行脱气处理，浇注在有SU．8微结构的硅片上，放置在800C的热板上固化1h，冷却后从硅片表面剥离，打孔，并切割成合适的大小备用。将制备好的具有微结构的PDMS和清洗干净的玻璃片或无结构的PDMS基片放入氧离子表面处理机中对其表面处理15s，取出后将二者迅速贴合，形成封闭的微通道网络，完成细胞培养微芯片的制作。1．2微芯片内细胞培养注入芯片内培养的细胞采用实验室常规培养的3T3细胞和B

8、．Cap细胞(上海市第九人民医院组织工程中心)。细胞培养液为DMEM(Gibco)，加入lO％的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)和100IlI佃I．的链青霉素(吉诺生物医药技术有限公司，杭州)，消化液为0．25％的胰酶和0．02％的EDTA(吉诺生物医药技术有限公司，杭州)。将制作好的细胞培养微芯片用75％的酒精浸润．然后放人常规细胞培养皿(P0lystyr％e