停循环相关脑损伤的大鼠海马线粒体COX蛋白获取及验证-论文.pdf

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1、云南大学学报(自然科学版)。2014，36(5)：788—794DOI：10．754o／j．ynu．20140236JournalofYunnanUniversity停循环相关脑损伤的大鼠海马线粒体COX蛋白获取及验证高永军，曹毅，袁勇，张喜兵，赵宁辉，徐蔚(昆明医科大学第二附属医院神经外科，云南昆明650101)摘要：为了明确不同脑温停循环对大鼠海马线粒体差异蛋白质的影响，探讨深低温停循环的脑保护机制，研究以16G导管和22G留置针分别穿刺颈内静脉和尾动脉，建立大鼠闭胸式体外循环模型．并在该模型下完成常温(35．5～37．5oc)和深低温(<27℃)状态下停循环10mi

2、n，提取海马组织并纯化线粒体，电镜超微结构显示线粒体纯度和完整性均良好，可以进行下一步研究．按照蛋白质组学要求取线粒体蛋白质匀浆，SDS—PAGE预实验显示标本符合蛋白质组学的需要．最后进行i—TRAQ标记的蛋白质组学分析，获取7个差异蛋白质(依据表达量>1．5倍或<0．67倍，P<0．05)．之后对其中的差异蛋白质——细胞色素C氧化酶进行深入研究，免疫荧光染色精确定性表明线粒体和细胞质的COX蛋白在NTCA和DHCA组间的分布是有差异的，West．erla—blot半定量分析提示3组之间COX蛋白表达量无明显变化(P>0．05)，由此判断急性期深低温停循环的脑保护作用与

3、其减少线粒体蛋白质COX向胞质的释放有关。关键词：线粒体；超微结构；免疫荧光；细胞色素C氧化酶；深低温停循环中图分类号：R651文献标志码：A文章编号：0258—7971(2014)05—0788—07深低温停循环(deephypothermiccirculationat—是依赖双向凝胶电泳(2D—PAGE)结合基质辅助rest，DHCA)能明显增强脑组织对缺血缺氧的耐受激光解析电离飞行时间(MALDI—TOF—MS)，该能力，停循环可以为手术提供相对无血的视野．自方法的优点是实验成本相对低廉，技术方法成熟稳2O世纪70年代，DHCA技术广泛使用于复杂先心定．由于双向电泳

4、对蛋白质的分离受到蛋白丰度、病、主动脉弓及胸主动脉等大血管手术中，能发挥等电点、分子量和疏水性等的限制，对于低丰度蛋有效的神经功能保护作用¨J．但是DHCA技术本白质、相对分子质量>200ku和相对分子质量<8身是一个“双刃剑”，随着停循环时间的延长，包括ku极小蛋白质、极碱性蛋白和疏水性蛋白都难以近期和远期的并发症逐渐增多，高死残率和严重脑进行有效分离¨．随着科学技术的进步，2004年损害并发症发生率在2．50％～10．82％之间．美国应用生物系统公司(AppliedBiosystemsIncor—同时DHCA技术本身会增加脑卒中的发生率poration，ABI)推出一

5、项新的体外核素标记技(1．8％～13．6％)及早期死亡率(6．1％～15％)，术——相对和绝对定量核素标记(IsobaricTagsfor发生在儿童会影响术后远期智力的发育．随RelativeandAbsoluteQuantitation，i—TRAQ)技术，着研究的深入，发现DHCA结合间断性脑低流量与该技术相伴随的是蛋白质标本的体外核素标记灌注或ACP／RCP能显著降低单独使用DHCA时试剂盒的成功开发．液相色谱一串联质谱(Liquid并发症的发生率⋯．Chromatography——MassSeparation／MassSpectra蛋白质组学始于20世纪90年代，

6、传统的方法Characterization，LC—MS／MS)也称液相色谱一二收稿日期：2014—05—16基金项目：教育部博士学科点基金(20095317110001)；云南省自然科学基金(2009CD177；2011FB200)；云南省卫生厅科技项目(2010NS070)．作者简介：高永军(1975一)，男，山西人，讲师，博士生，主要从事神经外科临床及低温脑保护方面的研究．E—mai1：619475466@qq．eom．通信作者：徐蔚(1962一)，男，江苏人，教授，博士生导师，主要从事神经外科l临床及脑保护方面的研究．E—mail：xuwei_301@yahoo．c

7、orn．第5期高永军等：停循环相关脑损伤的大鼠海马线粒体COX蛋白获取及验证789维质谱，是与蛋白质组学技术发展并行的蛋白质谱于新离心管中，经多聚甲醛一戊二醛固定，用二甲鉴定系统，与i—TRAQ技术结合，可实现蛋白质分砷酸钠缓冲液漂洗，50％，70％，80％，90％，100％离、鉴定和定量一体化完成．该技术可对复杂样本、乙醇梯度脱水，环氧丙烷包埋剂浸泡，环氧树脂包细胞器、细胞裂解液等样本进行研究，具有较好的埋剂包埋标本．经梯度聚合、修块后切片，用醋酸双定量效果和较高的重复性．目前在肿瘤、新药筛氧铀和柠檬酸铅进行双染色，JEM一