正交实验法对碱性磷酸酶活性测定的优化-论文.pdf

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1、50生物学通报2014年第49卷第7期正交实验法对碱性磷酸酶活性测定的优化冰史凌云t周婷徐成张媛媛赵小峰高梦於露贺玲(1徐州医学院临床医学系江苏徐州2210042徐州医学院医学生物化学与分子生物学实验教学示范中心江苏徐州221004)摘要碱性磷酸酶(ALP)是一种非特异性磷酸单酯酶，碱性条件下几乎能催化所有磷酸单酯的水解。采用正交实验法研究兔肝ALP的活性，在单因素实验的基础上，利用Minitab对碱性磷酸酶的催化条件(pH值、反应温度、酶量、底物量)进行4因素3水平的正交实验设计。正交实验结果表明．4种因素对酶

2、活性的影响由大到小排列顺序为pH值>温度>底物>酶，最佳组合为ACD，即酶量为0．4mL，底物量为0．8mL，温度50~(3，pH值为10时兔肝ALP的活性最强。关键词碱性磷酸酶ALP正交实验酶活性优化中国图书分类号：O55文献标志码：B碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，本研究在兔肝ALP分离纯化的基础上，通过ALP)是一类非特异性磷酸单酯酶，在碱性条件下正交实验对影响ALP活性的4种因素(底物量、可催化磷酸单酯的水解和磷酸基团的转移⋯。酶量、温度、pH值)进行研究，最终确定

3、ALP催化ALP广泛存在于生物界中，人体中有4种ALP同底物水解时的最佳反应条件。工酶。其中3种是组织特异的，包括胎盘型(PL—1材料与方法ALP)、生殖细胞型(GC—ALP)和肠型(I—ALP)，第1．1材料4种是非组织特异型(TN—ALP)，存在于肺、骨、肾实验材料：新鲜兔肝。等器官中E2]。研究发现，ALP水平的高低与炎症、试剂：醋酸镁。醋酸钠，碳酸钠，碳酸氢钠，阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)、帕哲病对一硝基苯磷酸二钠(pNPP)，氢氧化钠，4一氨基安(Paget’Sdiseas

4、e，PD)、损伤、肿瘤、肝病、VD缺乏替比林，铁氰化钾，苯酚，正丁醇(分析纯)，丙酮症等一系列疾病有关[z圳。ALP也是临床诊断的指(分析纯)，乙醇(分析纯)。标之一，测定血清中ALP的活力已应用于阻塞性1．2仪器JA3003N型电子天平，722N型分光光黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎度计，0412—2型低速离心机，电动匀浆器，HH一42等方面的检查_l0]。提纯的ALP则广泛应用于核数显恒温搅拌循环水箱，雷磁PHC一3C型pH计。酸、毒物学和医学领域的研究中⋯]。2实验步骤和方法Minitab是一

5、款功能强大的数据分析软件，不2．1酶的分离纯化ALP的分离纯化参照文献仅有数据管理、统计分析、图表分析、输出管理等基『13]的方法。本功能_l2]，其实验设计(designofexperiments，DOE)2。2酶活性的测定ALP活性测定采用苯基磷功能也很强大，Minitab提供的DOE功能有因子设酸钠终点比色法，实验步骤参照文献[13]。规定1计、响应面设计、混料设计及田口设计等。其中田口个酶活力单位为：37℃下保温15min产生1mg设计(Taguehidesign)模块具有正交设计功能，本酚者为1个酶活性

6、单位(U)。实验采用Minitab软件进行正交实验设计和结果2．3单因素实验分别研究不同酶量、底物量、分析。pH值、温度与ALP酶活性的关系。其中，酶量、底}基金项目：江苏省高等学校大学生实践训练计划项目(2012JSSPITP1871)}通讯作者2014年第49卷第7期生物学通报51物量换算成相应体积，以溶液体积代表不同浓度31，230．4￡∈313进行实验031)酶量对酶活性的影响。在不同量(0．2mL、美n8艟遵0摇0．6．20．4mL、0．6mL、0．8mL、1．0mL、1．2mL)条件下，0．4O．'测

7、定酶活性O22)底物量对酶活性的影响。在不同底物使用000．20．40．6081．01．20．20．4060．8101．2量(0．2mL、O．4mL、0．6mL、0．8mL、1．0mL、1．2mL)酶量(mL)底物量(mL)条件下，测定酶活性。图1酶量对酶活性的影响图2底物量对酶活性的影响3)温度对酶活性的影响。在不同温度(23oC、312兰31O3O℃、37℃、45℃、52℃、6OoC)条件下，测定酶活性。型84)pH值对酶活性的影响。在不同pH值(7．0、烬避88．0、9．0、10．0、l1．0、12．0)条

8、件下，测定酶活性。2．4正交实验根据单因素实验结果，每个因素设3个水平．利用Minitab软件工作表中“田口设7801O’112计”窗口，设计L9(3)正交表。因素水平如表1所pH值示其中因素A表示酶量．因素B表示底物量．因图3pH值对酶活性的影响图4温度对酶活性的影晌素C表示温度．因素D表示pH值。下文同。设计3．2正交实验结果分析在Minitab设计的L9结果如表2：