蓝舌病病毒BTV-1型的分离鉴定-论文.pdf

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1、《上海畜牧兽医通讯》2014年第4期·5’蓝舌病病毒BTV一1型的分离鉴定肖雷孟锦昕李楠高林何于雯杨恒胡骑李华春朱建波(云南畜牧兽医科学院650224)蓝舌病(BT)是由蓝舌病病毒(BTV)通过吸血试验所用的BTV24个标准毒及24个标准阳性血昆虫一库蠓叮咬传播，感染牛羊等反刍动物的一种清由我室保存和制备。非接触性传染病，分布于热带、亚热带和温带地区。1．1．4引物的设计与合成：根据基因库提供的主要侵害绵羊，其病症是颊黏膜和胃肠道黏膜严重BTV各基因序列，通过分析软件，对BTV较为保守的卡他性炎症，病羊精神沉郁，食欲丧失，常出现血的RNA7(VP7基因)片断设计引物：BT

2、V-S7一A：样下痢，常因蹄冠上皮脱落而跛行，被毛断裂，甚至5’一GTTACAATGCGCCCGACATC一3’；BTV—S7一全部脱落。蓝舌病病毒可经胎盘感染胎儿，引起流B：5’一TGTAATGCGGC：CTGTCCAT一3’。扩增产产、死胎或胎儿先天性异常，山羊和牛隐性感染，症物长度为555bp。引物由大连宝生物工程公司合状不明显，目前国际上的一些流行毒株可导致牛发成，用RNase—freeddH2O稀释成20pmol／gL生明显临床症状。备用。自1905年南非首次报道了蓝舌病以来，世界上1．1．5主要试剂及器材：总RNA抽提试剂(TR—许多地区有该病发生的报道，如美

3、国、澳大利亚、日izo1)，天根生化科技有有限公司，=j匕京；PrimeScript本等。1979年张念祖等在中国云南省师宗县首次OneStepRT—PCRKitVer2(DyePlue)试剂盒，宝发现该病并成功分离到病毒，从而证明蓝舌病在国生物工程公司，大连；PremixEXTaqVer2(1oading内的存在。DyeMix)，宝生物工程公司。细胞培养瓶(板)，全球已知至少有24个不同血清型的BTV，其Costar公司产品，二氧化碳恒温培养箱(IF-151，型与型之间不能产生或仅能产生较低的交叉保护，SAKURA，日本)，倒置相差显微镜(DMIL—Cplan，这对动物

4、的疫苗免疫造成很大的障碍。为明确本德国莱卡)，PCR仪(9700，ABI公司，美国)，凝胶成地区蓝舌病病毒的主要血清型，2012年，我实验室像系统(Bio—Rad，美国)，鸡胚孵化箱，组织捣碎机。在师宗县五龙乡建立了一个由10头经蓝舌病抗体1．2方法检测为阴性、半岁至一岁的黄牛组成的监控群(哨1．2．1病毒的分离。：选用动物血清学转阳前1周兵动物)，从5月份开始至1O月，每周采血1次，11的肝素抗凝血100gL，加入到含1mL无菌PBS月、12月每月采血1次，从8月初开始，第1头监控(pH：7．2)的1．5mL微量离心管中，颠倒混匀，动物出现蓝舌病血清学转阳，用该牛转阳前

5、1周的1500r／min离心10min，轻轻吸弃上清液，洗涤重红细胞，经蓝舌病病毒分离程序，分离到1株疑似病复3次。弃上清液加入900gL无菌双蒸水，涡旋混毒分离物，命名为BTVSZ一1。根据基因库提供的匀，确保红细胞裂解，用1mL注射器吸取备用。选BTV各基因序列，通过分析软件，对BTV较为保守用10～11日龄健康鸡胚，在暗室内选取贴壁血管的RNA7(VP7基因)片断设计引物，经RT_PCR检后，标记位置。用牙科电钻沿标记两侧切割，形成测，BTVSZ一1细胞培养液上清扩增到555bp的5×10cm的窗口，置37℃孵化箱中备用。在暗室VP7目地片段，初步确认为蓝舌病病毒。

6、经序列分中，进行鸡胚的静脉接种。每份样品接5枚胚，每枚析及细胞微量中和试验检测，该毒株为蓝舌病病胚注射0．1mL。接种后鸡胚于置35℃孵化箱中培毒，血清型为BTV一1型。养。逐日观察，24h内死亡的胚，可认为是非特异l材料与方法性死亡，弃之；24h后死亡的胚，4℃保存，连续观察1．1材料5d后，将活胚置4℃过夜。收获鸡胚肝脏。当1份1．1．1血液采集：用10mL肝素真空采血管无菌样品中出现死、活鸡胚时，应分别分开收取。该工采集监控动物颈静脉血液。作需在BSL一2生物安全柜中进行。将收获的鸡胚1．1．2细胞和鸡胚：蚊子细胞(C6／36)、幼仓鼠肾用组织捣碎机捣碎，PBS悬浮

7、，3000r／min离心细胞(BHK一21)或非洲绿猴肾细胞(Vero)由我室保10min，取上清液200uL接种长成单层的C6／36细存，1O～11日龄健康鸡胚购于云南云岭广大公司。胞管(瓶)中，28℃培养箱中培养7d，每天在倒置相1．1．3血清学检测：C—ELISA试剂盒由我室制备，差显微镜观察细胞病变(CPE)，出现CPE的细胞管抗原为我室保存制备的BTV-1型Y863毒株，中和(瓶)4℃保存；未出现CPE的细胞管(瓶)，冻融3次后，4℃保存。将收获的C6／36细胞样品接种于*为通讯作者长成单层的BHK一21细胞管(瓶)