口蹄疫抗体液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验模型的建立与案例分析-论文.pdf

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1、试验研究口蹄疫抗体液相阻断ELISA(LB-ELISA)试验模型的建立与案例分析周春炎(江苏省如皋市畜牧兽医站，如皋226572)DOI：10．3969／J．ISSN．1671—6027．2014．01．008液相阻断ELISA用于检测家畜血清中的口蹄2．1．9稀释液：0-05％(V厂v)Tween一20加入0．01MPBS，疫抗体。主要应用于两个方面的目的：(1)检测口蹄pH7．4(PBST)。疫病毒感染，广泛用于国际贸易中；(2)监测牛、羊2．1．10豚鼠抗血清稀释液：5％脱脂奶粉一PBST。和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫抗体，评价口蹄2．1．11洗涤液：0．0

2、1MPBST，pH7．4。疫疫苗免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻2．2主要仪器材料击能力。2．2．1ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板1反应原理(Nunc或costor)。抗原抗体反应板：96孑LU形底聚预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首丙烯微量板。先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包2．2．2移褶蔓暑导：0．5～20L，5～50L，50～200L，200～被了口蹄疫型特异性抗体的ELISA板中，没有完全1000I可调节移液器各一把，8道或l2道移液器被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体一把，移液槽5～6个，各配套移液枪尖若干。

3、(兔抗)捕获，亦与随后加入的豚鼠抗血清中的抗体2．2-337~C温箱。结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显2．2．4酶标仪：492nm波长滤光片。色。按照试验孔呈现的颜色与抗原对照(未加血清)2．2．5吸水纸巾。孑L呈现颜色相比较判断结果。抗体滴度以能阻断2．3试剂准备50％病毒抗原的血清稀释度表示。2．3．1包被缓冲液(pH9．6)：将试剂盒配备的碳酸盐2主要试剂与器材缓冲液胶囊1粒打开，将胶囊内粉末倒人lOOmL无2．1主t-试剂离子水中溶解即可，4保存，1个月内有效。2．1．1捕获抗体：口蹄疫病毒146s兔抗血清。2．3．2碳酸盐一吐温缓冲液(PBS

4、T)：使用前，将试2．1．2检测抗体：口蹄疫病毒146S豚鼠抗血清。剂盒配备的25倍的PBST浓缩液用无离子水或蒸2．1_3酶结合物：兔抗豚鼠IgG一辣根过氧化物酶馏水稀释成1倍PBST(以1份浓缩液加入24份水结合物。进行稀释)2．1-4病毒抗原：BEI(二乙烯亚胺)灭活的病毒细2．3．3底物溶液：取1片柠檬酸一磷酸盐片剂溶于胞培养物。100mL无离子水中，溶化后，取50mL本溶液，再加2．1．5标准阳性血清和阴性血清。1片邻苯二胺(OPD)片剂，充分溶解，分装，避光2．1．6底物溶液：邻苯二胺(OPD)／HO溶液一具一20％保存。体配制方法：取1片柠檬酸一磷酸盐

5、片剂溶于3操作步骤100mL无离子水中，溶化后，再加2片OPD片剂，充3．1包被ELISA板用包被缓冲液稀释兔抗血清分溶例分装成5mL或lOmL／瓶，避光一20度保存。至工作孑L加50L。震荡23rain，封板膜封板或湿用前避光溶化，临用时每10mL上述溶液加100L盆中室温过夜。配备的3％的双氧水。3．2抗原抗体(对照血清和待检血清)反应2．1．7终止液：1．25moL／LH2SO4。3．2．1根据不同的需要，在抗原抗体反应板上操作。2．1．8缓冲液：包被缓冲液：0．05MNa2CO3／NaHCO3，3．2．2稀释待检血清在U型血凝板上按5OpH9．6。孔量用PB

6、ST工作液将待检血清从1：4开始做2倍

7、毒抗原对照平均做2倍连续稀释到l：4，然后每孔加入50L稀释D492nm值的50％为临界值，被检血清稀释孑L到使用浓度的口蹄疫病毒抗原，病毒抗原对照孔加D492nm值大于临界值的孑L为阴性孑L，小于或等于100L。振荡强匀，封板，4℃过夜。加入病毒抗原后临界值的孔为阳性孔，阳性孑L的D492nm值等于临血清的稀释度变为从1：8开始的2倍稀释。或加入界值时所对应的稀释浓度为该份血清的抗体滴度。病毒抗原后血清的稀释度变为从1：16开始的2倍如临界值处于两个稀释孔D492nm值之间，抗体效稀释。价取相邻阳性孔和阴性孑L稀释倍数的反对数中间3．2．3用PBST洗ELIS