濒危植物延龄草初代培养中无菌培养物的建立-论文.pdf

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1、2014年7月四川师范大学学报(自然科学版)July，2014第37卷第4期JournalofSichuanNormalUniversity(NaturalScience)V01．37．No．4濒危植物延龄草初代培养中无菌培养物的建立李群，王丽(1．四川师范大学生命科学学院，四川成都610101；2．四川大学生命科学学院，四川成都610064)摘要：延龄草为国家三级保护植物，近几年，其资源数量急剧减少，急需寻找增加资源的途径．为了获得延龄草初代培养的无菌培养物，对延龄草初代培养中外植体所感染的微生物进

2、行分离纯化、形态学及生理生化鉴定，进一步对污染外植体进行抑菌处理．结果表明，外植体所感染菌株均为埃希氏菌属(Escherwhia)；在培养基中加200mg／L链霉素或300mg／L一氨苄青霉素能获得较好的抑菌效果；100mg／L链霉素或150mg／L一氨苄青霉素浸泡污染外植体6h也能获得较好的抑菌效果．该研究为延龄草离体繁殖体系的建立奠定了基础，从而为进一步从离体繁殖的角度扩大资源提供了可能．关键词：延龄草；分离纯化；鉴定；抗生素中图分类号：Q813文献标志码：A文章编号：1001—8395(2014

3、)04—0585—04doi：10．3969／j．issn．1001—8395．2014．04．027延龄草(TrilliumtschonoskiiMaxim)，俗名头顶min，用蒸馏水清洗后，放人超净工作台上的无菌广一颗珠，为百合科多年生草本植物，主要分布在中口瓶中，用体积分数75％的乙醇浸泡30S，无菌水国及日本¨，生长在海拔1600～3200m的阴湿环冲洗1次，再用质量分数0．1％的升汞消毒8min，境里．根茎含薯蓣皂苷，叶片含黄酮类化合物等有无菌水冲洗4次，每次停留3min．将消毒后的实验效成

4、份，具杀菌、止血、解毒等功效，主治头晕目眩、材料用无菌滤纸吸干水分，切成0．5cm大小后接高血压、神经衰弱症，是传统名贵中药之一l2J．近种，培养基为MSJ，不添加任何激素．然后将接种年来，由于生长环境恶化和过度采挖，加之延龄草材料放在20oC、2000Lx光照条件下，每天进行16种子休眠期长、发芽率低等生物学特性，导致种群h光照培养．15d后观察外植体污染情况．数量急剧下降，已被国家列为三级保护植物J．为1．2菌种的分离纯化挑取植物组织上的微生物了拯救资源，近年来一些单位对其进行迁地保护栽作为分离纯

5、化和鉴定的菌种材料．具体方法如下：培研究，但由于延龄草对环境条件要求较为特殊，用接种环挑取植物组织上的微生物，接种于牛肉膏异地栽培繁殖亦相当困难．采用离体培养快速繁殖蛋白胨培养基上J，37qc倒置培养，直至长出菌来挽救其种质资源是较为理想的方法．离体快繁中斑，分别挑取不同形态特征的菌落，划线于牛肉膏关键步骤之一是建立无菌培养物．本文拟对延龄草蛋白胨平板上进行分离，挑选典型单菌落，反复纯离体培养中初代培养物进行微生物分离与鉴定，采化，直到菌落形态一致，在显微镜下观察无显著差用抗生素抑制微生物生长，旨在获

6、得大量无菌培养别为止．物．该研究为延龄草离体繁殖奠定了基础．1．3菌种的形态学鉴定和生理生化鉴定根据文献[6—7]的方法进行．生理生化测试项目见表1．1材料和方法1．4对污染材料进行抑茵处理1．1植物材料本研究实验材料采自峨眉山雷洞1．4．1在培养基中添加抗生素在菌种鉴定基础上，选择几种抗生素按质量浓度梯度加入培养基中坪(海拔2750m)．将延龄草植株根和根茎以上部分去掉，用毛笔刷净根茎上的棕褐色物质，用流水(见表2)，培养基激素组合为MS+6一苄基嘌呤(BA)2．0mg／L+吲哚酸乙酸(IAA)1．

7、0mg／L．然冲洗24h．取出根茎，用5g／L洗衣粉水浸泡30收稿日期：2013—03—26基金项目：国家自然科学基金(30200023)资助项目通信作者简介：王丽(1968一)，女，教授，主要从事资源植物学的研究，E—mail：1wang2001@elong．con四川师范大学学报(自然科学版)第37卷表1延龄草初代培养物感染菌种的生理生化鉴定结果Table1Resultsofthebiochemicalandphysiologicalidentificationoftheinfectedbacte

8、riumoftheinitiationcultureofrl~iumtschonoskiiMaxim测试项目大肠杆菌枯草杆菌TM001TMO02过氧化氢酶实验++++油脂水解+一一一淀粉水解++一一质量分数2％NaC1++++质量分数5％NaC1++++质量分数7％NaC1++++pH值5．7++++精氨酸双水解酶+一++硝酸盐还原++++酪素水解++一一柠檬酸盐利用+一++M．R试验一一一一V．P试验+一++pH值6．4～6．77．0～7．27．2～7