鲤鱼血清白蛋白提取工艺及优化研究.pdf

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1、动物科学现代农业科技2014年第l5期鲤鱼血清白蛋白提取工艺及优化研究姜延颇‘徐建志：孙艳凤1田颖娜-(河北省唐山市曹妃甸区农林畜牧水产局，河北唐山063200；乐亭县水产局)摘要以鲤鱼为取血对象，使用等电点沉淀法、盐析法、优化法3种不同工艺提取鱼血清白蛋白，制备好足量血清待用。结果表明：等电点沉淀法所提取的鱼血清白蛋白量最少，其次是盐析法提取鱼血清白蛋白，提取量最多并且纯度最高的是改进的优化法。关键词鲤鱼；血清白蛋白；提取工艺；等电点沉淀法；盐析法；优化法中图分类号TQ464．7文献标识码A文章编号1007

2、—5739(2014)15—0286一O1血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富且极易纯将离心管放入高速冷冻离心机，于4℃以3500fmin离心化的蛋白质，是血液系统的重要组分，具有结合和运输内15min。取离心后沉淀溶于1mL蒸馏水中，将溶液装于透析源性及外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，袋中，放人pH值为7．4的柠檬酸一Na2HPO缓冲液中，搅抑制血小板和抗凝血以及影响动脉血管的渗透性等生理拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4存在。NH4+的检测：取功能。在过去的30年中，它以其特有的地位成为物理学家

3、、1mL透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，如果出现砖红色沉化学家和生物学家研究的一种典型的、理想的蛋白质，它淀，说明仍有NH4~存在。需继续透析。也是血浆蛋白中研究的最早和最清楚的组分。人血清白蛋1．3．3盐析沉淀法。用移液枪吸取上清(血清)1mL至10mL白(humanserumalb岫．HSA)及牛血清白蛋白(bovineserum离心管，量筒量取9mL底液，用移液管逐滴加入，在加的过album，BSA)的部分氨基酸序列于1975年即已得到。1982程中需不断摇晃或振荡，4oC静置2h后离心．于4℃以350

4、0年得到HSA的eDNA全序列。随后，对其他多种动物的血清r／min离心15min，收集上清，用1mol／L盐酸调节pH值至白蛋白的研究工作也相继展开，如爪蟾血清白蛋白，鲑鱼血4．5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵(pH=清白蛋白等。鱼类是最古老的脊椎动物，相对于大量的牛血4．5)的体积(0．11xV)，逐滴加入饱和硫酸铵(pH=4．5)，边加清白蛋白、人血清白蛋白研究文献，鱼血清白蛋白的提取工边振荡，4℃静置2h后离心。4℃，3000dmin离心20min，艺文献尚未见报道㈣。弃上清，沉淀用0．

5、5mLpH=7．4的柠檬酸一Na2HPO4缓冲液1材料与方法溶解。将剩余的0．4mL蛋白质溶液加入透析袋中，放入pH=1．1试验材料7．4的柠檬酸一Na2HPO缓冲液中。搅拌透析过夜至蛋白质试验用鱼为鲤鱼，体重1kg左右，由实验室购买。试验溶液中无NH4~存在。1．3．4优化法。取上清液0．5mL，向其中加硫酸铵0．5mL至鱼先在室内水族箱暂养3d，暂养用水为实验室的自来水，期50％饱和度放置2h以上，2．4℃，3500dmin离心15min后间用气泵进行增氧，暂养期间不喂料。试验容器为方形塑料取上清液。上清

6、液用1mol／L的HC1溶液调pH值至4．0，放水箱。试验用水为充分曝气24d以上的自来水，水温变化范置2h以上，4℃，3500r／rain离心15min取沉淀。用与库浆等围l0～l2℃，pH值为7．5～8．0，DO值保持在5mg／L。试验药体积的水溶解沉淀，加辛酸钠至浓度为1mg，L。调pH值至物使用前．取2个水族箱装满水提前曝气3d以备试验使用。6．4～6．5．70℃水浴保温30min。冷却后加硫酸铵到45％饱和1．2主要试剂与仪器设备度放置2h以上．3500dmin离心15min取上清。上清液调试剂：饱

7、和硫酸铵、1moFL盐酸、抗凝剂、奈氏试剂。仪pH值到4．0放2h以上，3500dmin离心15min取沉淀。除器设备：容量瓶、透析袋、pH计、数显恒温水浴锅、高速冷冻盐：将剩余的蛋白质溶液放透析袋中，放入pH值为7-4的离心机、电炉或加热板、抽滤泵、分析天平等。柠檬酸一N~HPO,缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中1．3试验方法无NH4~存在【。1．3．1血清的制备。鲤鱼的血液从尾静脉中采取，方法是首2结果与分析先用针管吸入少许抗凝剂，然后沿侧线刺入，针头刺到椎骨等电点沉淀法、盐析沉淀法、优化法3种提取工

8、艺1mL位置后斜插入椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼血清提取的白蛋白分别为0．2538、0．3815、0．5048mg。可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入蛋白质的溶解度与溶液的pH值有关，通常在溶液的部位之前。放人用抗凝剂润洗过的带盖塑料离心管中，加柠pH值等于某蛋白质的PI值时，该蛋白质的溶解度最小。可檬酸钠抗凝，室温静置3h，再以3000dmin离心15min，取是，大幅