酶循环法及其在酶法分析中的应.doc

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1、酶循环法及其在酶法分析中的应用杨昌国，许叶（宁波市医学科学研究所，浙江宁波315010）关键词：酶法分析；酶循环法中图分类号：R461.1文献标识码：A由于酶法测定的特异性好，检测简便，反应温和，无污染，且灵敏度较高(10～100umol/L)，已能满足体液中大部分物质的测定，因此在临床化学测定中已广为应用。随着临床化学的发展，体液中某些微量物质的准确测定逐渐显得重要。酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质（被测物）的测定方法。此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或

2、队靶物质的提取，而且该法不需要专门的设备，是一种前景广阔的测定技术。日本旭化成（AsahiChemical）公司发展了这一技术，笔者参考旭化成公司的有关资料，将这一技术介绍给国内的同行。1酶循环法的原理物质A在酶a和底物a(Sa)的存在下转化为物质B，同时生成产物a(Pa)；这物质B又在酶b(Eb)和底物b(Sb)的存在下转化为物质A，同时生成产物b(Pb)。上述反应每循环一次，将消耗与物质A等量的Sa和Sb，同时生成等当量的Pa和Pb。因此在一定时间内，循环反应的次数亦就是Sa和Sb消耗或Pa和Pb生成相当于物质

3、A(或物质B)的倍数，通过检测Sa或Sb的减少或Pa或Pb的生成就可以提供检测物质A(或物质B)的n倍灵敏度。见图1。底物a(Sa)产物a(Pa)Ka循环Kb酶a(Ea)物质A物质B酶b(Eb)产物b(Pb)底物b(Sb)图1酶循环法原理1.1条件1.1.1物质A和B的浓度与酶a和酶b对底物Sa和Sb的Km值相比较，应相当小，即[A]或[B]《KmSa(或KmSa)。1.1.2酶a和酶b对底物Sa和Sb的Km值应相当小，对底物应有高亲和力。1.2原理米氏方程v＝V•[S]/([S]+Km)，v＝K•[S]，(K＝V

4、/Km)。当t＝0、[A]=[A0]、[B]=0时，[A]＋[BA0]；当t≥0并假设反应已达到平衡状态，那么，Ea的速度是Vb＝Kb[A]。Eb的速度是Vb＝Kb[B]。在平衡状态时，va＝vb因此，[A]:[B]=Kb:Ka。循环反应速度vc＝va＝vb(固定的)，假设vc＝Kc[A0](Kc=循环速率常数)，那么从Kc＝Ka•Kb/(Ka+Kb)推导，如果Ka+Kb＝常数，当Ka＝Kb时，Kc是最大的。1.3测定灵敏度。2酶循环反应的灵敏度可通过产物的循环常数(Kc)和反应时间(t)来确定；Kc又可通过两种酶

5、的量来确定；酶量又取决于酶的特异活性和Km值，循环反应是在相同的条件(如温度、离子强度等)下进行，两种酶的反应常数亦相同(由于Va/Kma=Vb/Kmb，因此Kc＝Ka＝Kb)。既然循环反应的灵敏度可通过Kc×t(min)来确定，故可用调整加入酶量或反应时间来随意控制。选择Km小的酶，用较小的酶就能得到较高的灵敏度。3循环反应的类型按反应中使用的酶可分四种类型：1.1方法A底物循环，氧化酶和脱氢酶系统。氧化酶对靶物质氧化，脱氢酶又把氧化态的靶物质转化成还原态。靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，速率可达50～300

6、次/分。举例：溶血卵磷脂(lysolrcithin)(又称溶血磷脂酰胆碱，lysophosphatidylcholine)，是磷脂的一种，它随氧化型LDL和β－VLDL水平增高而增高，后两者已确认与动脉粥样硬化的发生和发展有关。测定原理见图2。预处理反应：测定反应：(1)(2)DAOS4-AAP(3)DAOS（比色测定）O2H2O2醌亚胺循环GPOG3PDHAPG3PDHNADNADH12α-HSD胆碱酮类胆酸GO：甘油氧化酶LYPL：溶血磷脂酶GPC：甘油磷脂酰胆碱GPCP：磷酸二酯酶G3P：3－磷酸甘油GPO：

7、甘油磷酸氧化酶DHAP：磷酸二羟丙酮G3PDH：3－磷酸甘油脱氢酶12α-HSD：12α-羟类固醇脱氢酶DAOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧苯胺图2溶血卵磷脂酶循环法原理1.2方法B底物循环，脱氢酶和辅酶系统。靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，仅用一种酶和两种辅酶(巯基NAD和NADH)。在410nm测定巯基NADH的增高速率，循环速率约100次/分。举例：胆汁酸测定，原理见图3。巯基-NAD巯基-NADH(415nm测定)循环3α-HSD胆汁酸酮类胆汁酸3α-HSDNADNADH3α

8、-HSD：3α-羟类固醇脱氢酶图3胆汁酸酶循环法测定原理1.1方法C辅酶循环，双脱氢酶系统。靶物质被转化为辅酶(NAD)，使用两种脱氢酶使NAD-NADH间循环。本系统灵敏度很高，循环速率至少可达1000次/分。举例：NH3测定，原理见图4。NH3三磷酸腺苷＋脱氨-NAD单磷酸腺苷＋PPiD-葡萄糖NAD甲月簪染料(比色测定)葡萄糖脱氢酶循环黄递酶D-葡萄糖