DB33T 2254-2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS65.020.30B41DB33浙江省地方标准DB33/T2254—2020猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法MethodofduplexfluorescencequantitativeRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiazhangchenrrheavirusandtransmissiblegastroenteritisvirus2020-04-08发布2020-05-08实施浙江省市场监督管理局发布DB33/T2254—2020前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某

2、些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江农林大学。本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、王晓杜、孙静、姜胜、周莹珊、杨永春、程昌勇、章先、杨杨、卫芳芳。IDB33/T2254—2020猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）双重荧光定量RT

3、-PCR检测方法的材料准备、样品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及结果判定。本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（Cyclethreshold）DEPC：焦磷酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

4、PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）PEDV：猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus)RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus）4试剂和材料4.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。0.01mol/LPBS和DEPC水配制中所使用的水应符合GB/T6682-

5、2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。4.2Trizol：RNA抽提试剂，2℃～8℃保存。4.3氯仿：2℃～8℃预冷。4.4异丙醇：2℃～8℃预冷。4.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，2℃～8℃预冷。4.6DEPC水：配置方法见附录A。宜直接购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。4.70.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法见附录A。1DB33/T2254—20202+4.82×OneStepRT-PCRbuffer（内含PCRbuffer、dNTPs和Mg）。4.9DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/µL）。4.10反转录酶

6、预混物（内含RNase抑制剂）。4.11阳性对照：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎灭活病毒混合物。4.12阴性对照：DEPC水。4.13用于RT-PCR反应的引物浓度为10µmol/L，探针浓度10µmol/L，其序列分别为：PEDV上游引物F：5’-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG-3’；PEDV下游引物R：5’-ACGAACAGCCACATTACCACCAA-3’；PEDV探针P：5’-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-3’，其5’端和3’端分别标记FAM和MGB；TGEV上游引物F：5’-AAGGAAGATGGCGACCAGATAG-3’；TGEV下游引物R：

7、5’-CACTTCTGATGGGCGAGCAT-3’；TGEV探针P：5’-CACGTTCACACACAAAT-3’，其5’端和3’端分别标记HEX和MGB；4.14一次性耗材：乳胶手套，灭菌离心管、荧光RT-PCR反应管、无菌PCR吸头。5器材和设备5.1电热干燥箱。5.2高压灭菌锅。5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃，最大离心速度可达12000r/min以上。5.4冷藏冰箱，冷冻冰箱（-80℃）。5.5荧光PCR检测仪。5.6微量移液器。6实验室分