DB34∕T 2795-2016 猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2795—2016猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法DuplexRT-PCRassayfordetectionofporcinetransmissiblegastroenteritisvirusandporcineepidemicdiarrheavirus文稿版次选择2016-12-30发布2017-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2795—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本

2、标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：潘孝成、张丹俊、赵瑞宏、沈学怀、戴银、胡晓苗、杨永新、周学利、侯宏艳、王重龙、李庆岗、张玉、王杨龙、陈福军、何为俊。IDB34/T2795—2016猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪流行性腹泻病毒（PEDV）二重RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中TGEV和/或PEDV核酸的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。TGEV：猪传染性胃肠

3、炎病毒(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus）PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

4、Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）3主要仪器3.1PCR扩增仪。3.2台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。3.3电泳仪。3.4凝胶

5、成像系统。3.5冰箱（-20℃；-80℃）。3.6微波炉。3.7分析天平（准确度0.01g以上）。3.8水浴锅。3.9微量移液器（2.5µL；10µL；200µL；1000µL）。4试剂和材料1DB34/T2795—20164.1RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。4.2氯仿、异丙醇、无水乙醇。4.3M-MLV反转录酶。4.4RNA酶抑制剂。4.5DEPC处理的灭菌水。4.6TaqDNA聚合酶。4.7dNTP。4.8DNA分子质量标准（DL2000DNAMarker）。4.9RT-PCR反应试剂。4.10EB（10µg/µL）或

6、核酸染料。4.11磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的A.1。4.1250×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。4.131％琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。4.14引物：——TGEV扩增上游引物，5’-TTACAAACTCGCTATCGCATGC-3’，下游引物，5’-TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC-3’；——PEDV扩增上游引物，5’-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3’，下游引物，5’-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’，引物浓度均为10pmol/µL。4

7、.15对照样品：——阳性对照样品：猪传染性胃肠炎病毒（VERO细胞培养）与猪流行性腹泻病毒（PK15细胞培养）的细胞培养混合物或猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联弱毒冻干活疫苗；——阴性对照样品：正常细胞培养混合物（VERO和PK15细胞）、正常猪肠道内容物或正常猪粪便样品。5样品的采集及处理5.1采样工具15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。5.2采样方法5.2.1肠内容物的采集与处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物1g左右，按1:5倍体积加入PBS，研磨冻融3次，装入15mL灭菌

8、离心管中，8000g离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。5.2.2粪便的采集与前处理取发病猪