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《利用16s_23srdna间隔区快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、河北科技师范学院学报第25卷第1期,2011年3月JournalofHebeiNormalUniversityofScience&TechnologyVo.l25No.1March,2011利用16S-23SrDNA间隔区快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种*刘广锦,陈绵绵,商可心,范洁,张炜,姚火春,陆承平(南京农业大学动物医学院,江苏南京,210095)摘要:利用16S-23SrDNA间隔区(ISR)长度和序列的多态性,结合16SrDNA和23SrDNA的保守性,分别在16SrDNA末端和23SrDNA前端保守区设计上下
2、游引物,进行PCR扩增。结果为21株猪链球菌均扩增出长度约为1200bp的片段,8株马链球菌兽疫亚种均扩出约1300bp的片段,其他属菌株和阴性对照无结果。因此,由PCR产物长度的不同就可快速区分猪链球菌和马链球菌兽疫亚种,这种基于ISR的PCR技术为鉴别病原微生物提供了更加简捷的方式。对2株代表菌(HA9801,ATCC35246)的16S-23SrDNAISR进行测序发现,猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的ISR差异主要表现为碱基的缺失。关键词:猪链球菌;马链球菌兽疫亚种;16S-23SrDNA间隔区;聚合酶链式反应中图分类
3、号:S851.3文献标志码:A文章编号:1672-7983(2011)01-0009-07猪链球菌病(Porcinestreptococcaldisease)是由多种溶血性链球菌感染引起的猪的一种多型性病,包括急性型的败血症和慢性型的关节炎、心内膜炎、淋巴结脓肿、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等。通过流行病学调查,本病在我国各地均有发[1]生,猪链球菌与马链球菌兽疫亚种是我国猪源链球菌病的两种主要病原。猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是1987[2]年由Kilpper-Balz等提议建立的1个新种,能引
4、起猪和其它家畜及人类的多种临床疾病,按照其荚膜抗原的差异,目前[2]分为35个血清型(1-34,1/2)和相当数量无法定型的菌株,其中猪链球菌1型、1/2型、2型(S.suisserotype2,SS2)、7[3]型、9型属于在世界上流行较广的致病性血清型,对养猪业及公共卫生均构成严重威胁。马链球菌兽疫亚种(Strepto-coccusequisubsp.zooepidemicus,S.zooepidemicus)属于兰氏分群的C群链球菌,其没有宿主专嗜性,可感染牛、猪、猴子和[4~6][7,8]羊,人类因食用污染的食物或
5、与发病动物密切接触后,亦可引发该菌感染,是一种重要的人兽共患病的病原。[9]1977年四川地区发生过该病的大流行,造成30多万头猪死亡,迄今为止仍呈地方流行。因此,建立快速、敏感、特异的检测方法来鉴别这两种病原菌,对防制猪链球菌病具有重要作用。在16SrDNA与23SrDNA之间,有一段连接序列,称为16S-23SrDNA间隔区(16S-23SrDNAgeneintergenicspacerre-[10]gion,ISR),是非功能区,所处的选择压力很小,进化速度是16SrDNA的10倍,Schlege等报道了ISR分析是
6、一个鉴定链球菌属内的种(包括猪链球菌)的很有力的工具。因此,笔者就从16S-23SrDNAISR的高进化率特征入手设计引物,使用PCR方法区分导致猪源链球菌病的两种重要病原)))猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种。随着当前生物信息学的快速发展,许多重要的人畜共患病病原的全基因组序列和16SrDNA,16S-23SrDNAISR,23SrDNA序列都已公布,可以在美国国立生物技术信息中心(NCBI)和英国基因组研究中心(Sanger)免费下载。同时,还可利用NCBI中Primer-BLAST功能,以GenBank中收录的大量核苷
7、酸序列作为模板进行/虚拟PCR0,为设计正确的PCR引物和检测引物的特异性提供了优越的平台。本实验就是先下载大量序列进行分析比对,分别在16SrDNA末端和23SrDNA前端保守区设计了上下游引物,在Primer-BLAST中验证引物的特异性,然后再进行PCR的操作,确保实验的真实可靠性。通过PCR,发现实验中的21株猪链球菌均扩增出长度约为1100bp的片段,8株马链球菌兽疫亚种均扩出约1300bp的片段,其他属菌株和阴性对照无结果。这样,由PCR产物长度的不同就可快速区分猪链球菌和马链球菌兽疫亚种。最后,将代表株(HA
8、9801,ATCC35246)的PCR产物进行测序,进一步验证了实验的准确性,同时也发现猪链球菌和马链球菌兽疫亚种ISR最大的差异表现为猪链球菌有一段172bp基因的缺失。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株本实验室保存的12株猪链球菌2型;6株猪链球菌9型;猪链球菌1型,1/2型,7型各1株;8株马链
