大豆根际解磷菌的鉴定-论文.pdf

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1、江苏农业科学2014年第42卷第8期·-——363-——李丽丽，郎敬，杨洪一，等．大豆根际解磷茵的鉴定[J]．江苏农业科学，2014，42(8)：363—365大豆根际解磷菌的鉴定李丽丽，郎．，杨洪一，邰飞飞，来永才(1．黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省林业科学研究所，黑龙江哈尔滨150081；4．东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040)摘要：利用PVK平板，从大豆根际土壤中分离出8株解磷

2、菌。培养分析结果显示，这8株解磷菌的溶磷圈均较大。其中，海伦Ⅲ号为革兰氏阴性菌，其余均为革兰氏阳性菌。形态学观察结果显示，北安I号为链球菌，海伦Ⅱ号、海伦Ⅲ号为球菌，海伦Ⅳ号、北安Ⅲ号为杆菌。基于细菌核糖体16SrDNA序列对北安Ⅲ号菌株进行鉴定，结合形态特征确认该菌株为巨大芽孢杆菌，经研究发现该菌株是一种重要的微生物资源，可进一步开发为生物磷肥。关键词：解磷菌；溶磷圈；16SrDNA；大豆；生物磷肥中图分类号：S154．3文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014)08—0363—03土壤中存

3、在一些特定的微生物，能够将植物难以吸收利将菌液涂布于载玻片上，干燥，固定，结晶紫初染1min，水洗用的磷转化为可吸收利用的形态，这些微生物被称为解磷菌，至无色；碘液媒染1min，水洗至无色；95％乙醇脱色30S，水以细菌为主⋯。将解磷菌作为肥料施入土壤，通过其生长代洗至无色；最后沙黄复染1min，水洗至无色，干燥，镜检。谢可以在作物根际形成一个磷供应较充分的微区，从而改善1．2细菌总DNA的提取作物磷元素的供应，增加作物磷素吸收量，提高作物产量，同接种菌株置于LB液体培养基中，于130r／min下振荡，时

4、还可以增进土壤肥力、增强植物抗病和抗旱能力。因37℃过夜培养。取1．5mL新鲜菌液于EP管中，于此，解磷菌的筛选及鉴定是当前微生物学研究的热点。土壤4000r／min下离心308，弃上清，收集菌体；an100p,g／mL溶中解磷微生物种类丰富、数量较多，目前报道的具有解磷菌酶5O，于37℃下处理1h辅助裂解；加入预热的CTAB作用的细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudo—溶液500ILL，充分混合，于65℃水浴30min，混匀；冷却后，morla$)、土壤杆菌属(Agrobacte

5、rium)、固氮菌属(Azotobacte)、加入等体积的三氯甲异戊醇(24：1)抽提，颠倒充分混根瘤菌属(Bradxrkizobium)、硫杆菌属(Thiobacillus)、肠细菌合，10000r／min离心10min；取上清液，加入等体积三氯甲属(Enterbacter)、微球菌属(Microeoccus)、沙门氏菌属(Salmo—烷／异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，10000r／rain离心5min；nella)、色杆菌属(Clromobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、取

6、上清，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀30min，8000r／min节细菌属(Arthrobacte)、大肠杆菌属(Escherichia)等。解磷离心10min；弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次；在超净工作微生物在我国应用较早，有较好的应用前景，但发展不快，应台上风干DNA，溶于20去离子水中。用还不普遍。筛选高效微生物肥料菌株手段单一、菌种种类1．3PCR扩增少是影响微生物肥料发展的重要因素，因而有必要对土壤中利用细菌核糖体16SrDNA通用引物27F／1492R进行的解磷菌进行大规模筛选，并进行系统鉴定

7、，丰富菌种资源，PCR反应，其反应体系20，包括10×PCRBufer2．0wL、但土壤中的细菌种类极为丰富，通过常规的形态学和生理生dNTPmix1．6IxL、25IzmoL／mL引物27F／1492R各0．4p．L、化方法难以进行有效的鉴定。笔者所在的实验室在前期研究TaqDNA聚合酶1U、模板DNA1wL，去离子水补足至中获得了8株解磷菌，本研究对这些分离到的解磷菌进行了20wL。PCR反应条件为：94℃4min；94℃30S，52℃30S，形态观察及分子鉴定，为丰富解磷微生物菌种资源打下基础。72

8、oC1．5min，30次循环；72℃7min；4℃保温。1．4回收及测序1材料与方法利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，1．1染色及显微观察将纯化产物送至大连宝生物公司进行测序。利用BLAST工利用革兰氏染色法⋯对筛选到的高效解磷菌进行染色，具在GenBank中对获得的序列进行分析。经过NCBI比对后下载相关菌株的细菌核糖体16SrDNA序列，所得序列用收稿日期：2014—02—06ClustalX1．81程序进