几丁质培养基制备.doc

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1、一、儿丁质分解菌的分离几丁质也称壳多糖或称甲壳素，广泛地分布于海沙、海泥、海水、淡水和土壤，以及吃儿丁质的头足类动物的胃肠，虾、蟹体表中.如几丁色色杆菌、嗜几丁杆菌、呈色几丁杆菌和蚀几丁芽孑包杆菌等。它们将几丁质分解成中间产物醋酸与还原糖，最终产物为二氧化碳与氨.1・几丁质培养基制备(1)几丁质的制取：洗净蟹壳或将大海虾壳浸泡在1%HC1中7天，(2天换盐酸溶液1次)脱去壳的钙质，使壳变得柔软而有韧性。然后用水洗净外壳，剪成1X3厘米壳条。用2%氢氧化钾溶液浸泡壳条10天，每2天加热一次，加热的温度低于沸点为宜，借以除去几丁质

2、以外的其他物质，如色素和蛋白质等。用蒸耀水洗净壳条上的碱，然后用乙醇抽提数次.玄到全部颜色脱净为止。这样的儿丁质适用于液体培养基培养未纯化的细菌，和保存儿丁质分解菌.如用于琼脂培养基中的儿丁质，必须将这种去净杂质的儿丁质研细分散于培养基中.这可用去杂质的若干几丁质条放于3升的瓶中,在另一个烧瓶中准备好1500毫升冷水，用100毫升5%的硫酸加到装几丁质条的烧瓶中，当儿丁质刚溶解完时，迅速加入已准备好的1500毫升冷水将酸稀释，静置过夜，使几丁质重新沉淀出来，轻轻倒出上清液.反复离心，洗涤沉淀至使石蕊呈中性。或将几丁质放在一个透

3、水的玻璃纸袋里悬挂在流水中，使酸透析完全。按1：10,使儿丁质重新悬浮于水中。取5毫升悬液于直径10厘米培养皿时，以仍呈轻微而又清晰的乳白色为宜。将悬液分装于试管中，每管10毫升，于121°C下灭菌15分钟。（2）几丁质无机盐培养基制备：K2HP041.0克MgSO4•7H200.5克NaCl海水菌用30克淡水菌0.5克CaCl2•2也00.1克FePOi-2H.00.001克NH.C11.0克氏01000毫升溶解上列无机盐类，调pH为7.0分装于试管中，每管10毫升,各管加1条去杂质的几丁质条，于121°C蒸汽下灭菌15分钟

4、，冷后保存待用，（3）无机盐琼脂培养基：将上述培养基的无机盐成分全部溶于水后，加入2%的琼脂（不加几丁质）加热溶解之，调pH为7.0,分装于试管中，分与每管5毫升和10毫升的两种，在121°C蒸汽中灭菌15分钟.（1）儿丁质琼脂培养基：K2HPO40.7克KH.PO,0.3克MgSOj•7氏00・5克FeSOi-7H200.01克ZnSO,0.001克琼脂10克蒸馆水1.0升Ph7.0以上为基础培养基，以121°C蒸汽灭菌20分钟、每100毫升加20毫升胶体几丁质悬浮液和5毫克放线菌酮，或制成用丁分离放线菌的双层平板.底层用基

5、础琼脂和放线菌酮，上层用胶体几丁质培养基。(2)胶体几丁质的制备：取净几丁质15克加浓盐酸100毫升,于冰浴中揽拌20分钟，离心，将上清液倒入冷蒸锢水中使再沉淀，同时将沉淀物用浓盐酸再行处理，如此重复数次。最后加足蒸憾水于沉淀物中，搅拌，便成奶油状，再用氢氧化钠溶液调pH至7.0,分装入广口瓶，每瓶20毫升121°C蒸汽下灭菌20分钟。将5g细粉儿丁质溶于88ml浓盐酸中，此儿丁质成胶状，在4°C放置24ho然后用玻璃纤维过滤500ml去离子水中，同时搅拌。然后通过离心方法将其反复洗至中性，最后加适量去离子水高压灭菌后保存。