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1、细胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2009,31(5):726-730http://www.cjcb.org甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞建系方法的探讨张 寰 李 瑄 苗 麟 王红托 张爱君 杜 贺 杨 青 秦启联*(中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京100101)摘要 本研究以甜菜夜蛾幼虫脂肪体组织为材料,探讨最初该细胞通过原代培养从组织中游离出不断增殖,经过数次传代,最终建立细胞系的过程以及培养过程中污染控制、培养基结晶对原代培养的影响等。结果表明,贴壁处理对原代细胞的游离具有重要作用
2、,经贴壁处理,有62%的培养出现游离细胞;游离出来的细胞持续增殖,能够布满培养表面并进行传代的比率为33%;最终有15%的原代培养建系成功。起始培养至首次传代成功的平均时间是85天。污染和培养基结晶是原代培养失败的重要原因之一。昆虫细胞系最重要的应用就是研究杆状病毒,或1.2主要试剂者通过杆状病毒载体系统表达外源蛋白质。由于杆细胞培养液TNM-FH购自Sigma公司(Cat.No.状病毒复制和感染的专一性,每种病毒的扩增都需要T1032),配制时加入10U/ml青霉素和10mg/ml链霉相应同源的细胞系。缺乏对特定病毒敏感的细胞系,素;胎牛血清(
3、fetalbovineserum,FBS)购自哈尔滨江已经成为该病毒相关研究的瓶颈。因此,更多种类和海生物工程公司。苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)为来源的昆虫细胞系一直受到昆虫病毒研究者的欢迎,国产分析纯。也是昆虫病毒学研究的重要内容之一。昆虫细胞原PTU饱和TNM-FH培养液:在TNM-FH培养液代培养工作十分繁琐,环节很多,探讨培养条件和操中加入过量的PTU晶体,充分搅拌后,静置过夜。取作细节,对于成功建立细胞系具有十分重要的意义。上清液过滤除菌。昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有相似的功原代培养液:其中TNM-FH、FBS、
4、PTU饱和能,是重要的生理代谢组织,也是杆状病毒侵染、复TNM-FH的比例为8∶1∶1。制的主要部位之一。目前已经建立了约30株昆虫脂传代细胞培养液:含有10%FBS的TNM-FH。肪体或脂肪体与卵巢混合物来源的细胞系,数量仅占条件培养液:甜菜夜蛾脂肪体细胞系IOZCAS-所有已建立昆虫细胞系的5%。目前,虽然有关新的Spex-II[13]传代培养于含10%FBS的TNM-FH培养昆虫细胞系建立及特性的报道较多,但对细胞系建立液中,当细胞生长到对数生长期时,吸出其中的培养方法的探讨较少[1~12]。本研究以甜菜夜蛾脂肪体组液,1000g离心10m
5、in,吸取上清液,用0.22mm的滤织为实验材料,探讨昆虫脂肪体细胞系建立的方法,其膜过滤后备用。条件培养液现配现用。中包括原代培养的条件,最初几次传代培养过程中的1.3原代培养相关因素,如取材的虫龄、脂肪体组织块大小、对在超净工作台内,将末龄后期至化蛹前甜菜夜蛾组织块的处理、培养基是否出现结晶等,以及这些幼虫浸于70%乙醇,体表消毒10~20min,用无菌吸因素对培养过程中细胞在体外分离和增殖的影响。水纸吸干虫体表面的乙醇,放入装有Ringer’s生理盐水的培养皿中解剖虫体,获得脂肪体组织,充分清洗1材料与方法脂肪体组织以除去血细胞,将多块脂肪
6、体组织用尖嘴镊转移到含有1ml原代培养液的T-25cm2塑料培养1.1材料实验昆虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)来自中国瓶(Corning,NY,14831)中,放入27℃培养箱中培养。科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家收稿日期:2009-04-13 接受日期:2009-08-24重点实验室昆虫病毒学研究组实验室,以甜菜夜蛾人北京市自然科学基金(No.5093028)和中国科学院知识创新工程重点工饲料在26±1.5℃、65%~75%相对湿度的条件下方向项目(No.KSCX2-YW-G-040)资助饲养。*通讯作者。Tel
7、:010-64807056,E-mail:qinql@ioz.ac.cn张 寰等:甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞建系方法的探讨727过夜后,加入2ml传代培养液。加入传代培养液时,的细胞于T-25cm2的培养瓶中,27℃贴壁培养12h,注意不要触动贴壁的组织。以后每7天更换2ml传去掉培养液后,加入1mlSeNPVBV,27℃培养1h,中代培养液,待细胞长满瓶底后开始传代[4,12,13]。间晃动3次,最后加入5ml新鲜传代培养液。3~51.4传代培养天后观察感染情况。第一次传代和最初几次的传代采取更换二分之一体积培养液的方法。将培养液连同悬浮的细胞全2
8、结果部吸出放入新培养瓶,并加入2ml传代培养液;而原在体外培养不同种类昆虫脂肪体组织,其贴壁能瓶(含脂肪体组织块)中加入4ml传代培养液
