一种土壤微生物总dna的高效提取方法①

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1、DOI:10.13758/j.cnki.tr.2004.06.015土壤(Soils),2004,36(6):662~666①一种土壤微生物总DNA的高效提取方法1121,2*黄婷婷曹慧王兴祥崔中利（1南京农业大学农业部环境微生物工程重点开放实验室南京210095；2中国科学院南京土壤研究所南京210008）摘要获得高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。本文采用间接法(菌体细胞回收法)提取红壤地区两种土壤类型的土壤微生物总DNA，定量计算其回收率，并与直接法(细胞原位裂解法)比较了提取效率和纯度

2、。结果表明：红壤地区2种土壤每克干土的总DNA提取量，间接法约为0.34和0.53µg/g干土，直接法约为13.62和24.32µg/g干土；间接法的提取效率低于直接法，但所得DNA片段较大，且Sau3AⅠ酶切和16SrDNA通用引物PCR扩增结果显示，间接法比直接法更能有效地去除土壤中的某些抑制剂，所得总DNA的纯度更高，有利于后续操作。关键词土壤微生物；总DNA提取；细胞回收；粗DNA纯化中图分类号S154土壤微生物生态系统极为复杂，在很大程度上直接对样品进行裂解，然后从裂解物中获得DNA；还是未知的。土壤微生物不仅是土壤中物质循环的而间接法

3、则是先从土壤中回收细胞再提取DNA。和驱动力，其代谢物也是植物的营养成分，其活动能直接法相比，间接法获得的DNA分子量更大，纯[1,2]直接影响到土壤的物理、化学性质。可以说，土度更高，但不可避免的，该法得到的DNA产率有壤微生物生态系统是一个巨大的、潜在的科研和经所降低。由于人们普遍认为较高的DNA得率更能[10]济价值远未得到开发的微生物资源库。目前可在实代表大部分的土著微生物种群和遗传多样性，目验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的前进行基因文库构建时大多仍采用直接法提取土壤1%，还有相当多的菌种因为无法人工培养而未被人总DNA。但最近

4、研究显示，直接法包含的高DNA[3]类所认识。随着分子生物学技术的发展，PCR的得率并不一定代表了种群的丰富度，并且序列的代指纹技术、DNA文库、FISH、Microarray等技术被表性也受到所采取的不同提取方法的影响，且有研广泛应用于土壤微生物群落结构以及基因资源的开究发现由直接法建立的基因文库中还包含了大量真发利用，丰富拓展了人们对土壤中不可培养微生物核生物的基因片段。由于真核生物基因增加基因文[4,5]的认识。库的大小但其遗传信息并不能在原核宿主载体中表分子生物学技术研究土壤微生物群落结构的实达，因此间接法为构建更高质量的基因文库提供了[

5、11]质是用土壤微生物DNA的不均一性来反映土壤微条件。本文采用间接提取法对两种植被条件下红生物的种群结构特征。因此，获得高浓度、大片段、壤的总DNA进行提取，并与直接提取法比较了提多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA取和纯化的效率，为红壤地区微生物群落结构多样是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。由性分析以及功能性基因的获得奠定了基础。于土壤样品中含有较多的腐质酸和粘粒等抑制物1材料与方法质，这些物质可对内切酶消化、PCR扩增、杂交等[6,7]后续操作产生强烈的影响，因而提取与纯化土壤1.1研究区域概况与土壤样品采集[8,9]微生物

6、总DNA在研究中尤为重要。研究区域位于江西省鹰潭市余江县。该区域具已报道的从土壤样品中提取DNA的方法有很有中亚热带温暖湿润的季风气候，年均温为17.8℃，多种，主要可分为直接法和间接法两类。直接法是年均降雨量为1785mm，且主要集中在4~6月；地①国家自然科学基金项目（40371069），中国博士后科学基金项目（2003033495）和中国科学院创新项目(KZCX3-SW-417)资助。*通讯作者(czl@njau.edu.cn)第6期黄婷婷等：一种土壤微生物总DNA的高效提取方法663形为低丘岗地，海拔35.0~54.6m，坡度为5°~8°

7、；品重1kg。土壤采集后，用布袋封装，以增加样品土壤为第四纪红粘土发育的红壤[12]。的通气性。样品带回室内，除去根系、石块等杂物，选择旱地和水田两种红壤粘土类型。土壤样品再过4mm筛，保存在4℃冰箱，1周内完成土壤总为5点混合样品，采样深度为0~20cm，每个土壤样DNA的提取。供试土壤理化性质见表1。表1供试土壤的理化性质Table1Physico-chemicalpropertiesofsoilstestedpH含水量全N全P全K有机质土壤类型（KCl）（g/kg）（g/kg）（g/kg）（g/kg）（g/kg）水田红粘土3.98304.8

8、1.300.5211.8524.57旱地红粘土4.41214.91.320.6711.4320.991.2主要试剂吹干后溶解于200µl