实验六 石蜡切片法1分析.ppt

《实验六 石蜡切片法1分析.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在PPT专区-天天文库。

1、实验六石蜡切片法——包埋、切片和贴片石蜡切片法石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握，同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。石蜡切片的主要过程取材——固定保存——冲洗——脱水————透明——石蜡透入——包埋——修块——切片——贴片——复水——染色——脱水——封藏——观察保存（一）包埋（二）修块、切片、贴片（三）染色、封藏一、实

2、验目的掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求；熟练掌握石蜡切片的关键步骤——包埋。学习旋转切片机的使用方法，熟练掌握石蜡切片的关键步骤——切片。二、实验材料及用品实验材料：植物叶片、小鼠肝脏实验用具：载、盖玻片；温箱、包埋盒、水盆等、切片机、毛笔等。实验药品：石蜡、蛋白黏贴剂。三、实验步骤（1）取材（根据制片目的和要求而定，代表性）；杀死和固定：小鼠利用引颈致死法迅速杀死，取其肝脏，用生理盐水冲洗干净后分割成0.5~1cm×0.5~1cm×0.3cm小块投入Bouin’s固定液中进行固定；植物叶片采集后分割成1~1.5c㎡小块后

3、投入FAA固定液中进行固定；冲洗小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用70%或50%AL进行冲洗；植物叶片经FAA固定液后使用流水进行冲洗脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？）50%70%80%95%100%AL100%AL脱水时间：视材料的性质、大小而定小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h；植物叶片：在各级AL中停留2-4h；注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜，则停留在70%酒精中。三、实验步骤（2）透明（置换，作用？）常用透明剂：二甲苯；透明原则：低浓度到高浓度（½二

4、甲苯+½100%酒精二甲苯二甲苯）透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果：（1）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。（2）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。浸蜡：要点：使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地贴在细胞壁的内外，成为不可分离的状态；原则：低温高温、低浓度高浓度三、实验步骤（3）包埋：

5、就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸盒中，使之凝固。包埋前折纸盒包埋时将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速且轻轻地用温镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢平放于水盆的水面上，待蜡盒内的石蜡表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水从一边浸入纸盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋块迅速凝固，待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。包埋过程中易出现的问题及解决办法问

6、题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出薄的切片。原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。三、实验步骤（4）修块：削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成

7、金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm；修块的目的：1）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲；2）每个切片组织的距离接近，便于镜检或作连续切片。要求：组织块必须①上下平行，②但左右的蜡、上下的蜡不要太多或太少；③正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。三、实验步骤（5）切片：用锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，一般用专门的切片机和切片刀。切片机的结构：控制切片厚薄的微动装置；供装切片刀的夹刀部分；供装置组织块的夹物部分。切片机的类型根据结构分为：滑行式切片机：夹刀部分是滑动的，而夹物部

8、分是固定的，可上下升降；旋转式切片机：夹物部分式上下移动，前后推进，而夹刀部分则固定不变。三、实验步骤（6）切片的步骤：将已经修整好的蜡块装在样品固定器上，并固定好；将切片刀安装在切片机的刀架上，调节切片刀的角度为15°左右，并固定好；调节切片的厚度：棉花叶片：8-10um；小鼠肝脏：6-