胃癌患者外周血中ck―19的表达及其临床意义.doc

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1、胃癌患者外周血中CK-19的表达及其临床意义［摘要］目的检测胃癌患者外周血中CK-19和MUC-1的表达，确定其作为早期胃癌微转移分子标志物的可能性；讨论CK-19mRNA对早期胃癌微转移的临床诊断意义。方法研究对象共分为三组，其中2009年3月〜2012年3月期间于陕西省安康市中心医院住院的96例初治胃癌患者作为实验组，30例胃良性疾病患者和30例健康人的外周血分别作为对照组。采用RT-PCR法检测实验组及对照组的外周血中CK-19mRNA及MUC-1mRNA的表达情况并评估目的基因的表达与临床特征的相关性，对结果进行统计学分析，选取出合适的标本进行PT-QP

2、CR实验。RT-QPCR法检测44例早期胃癌患者外周血中CK-19mRNA的表达量，通过绘制ROC曲线，探索诊断效果最好的临界值并计算AUCo结果①实验组和对照组中CK-19mRNA阳性表达率分别为53.13%(51/96)、1.67%(1/60),差异有高度统计学意义(P0.05)o②本实验结果统计的临界值为0.2358,灵敏度为95.45%,准确度为77.37%；AUC为0.897。结论RT-QPCR法检测外周血中的CK-19mRNA,适合作为诊断早期胃癌微转移的重要参考指标。［关键词］胃癌；CK-19；RT-QPCR；外周血［中图分类号］R734.2［文献

3、标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)05(b)-0004-04胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，有发病率高、转移率高、病死率高、早期诊断率低、根治切除率低、5年生存率低等特点。胃癌的死亡大多由于手术及化疗后的复发和转移，因此肿瘤微残留或微转移是影响胃癌患者预后的重要因素。RT-PCR已广泛应用于检测肿瘤患者在外周血、淋巴结、骨等病灶的微转移，且显示了较高的敏感性和特异性［1］。在影像学意义上，当肿瘤细胞还没有形成转移结节前，某些肿瘤相关标志物就会出现在外周血内。因此，选择合适的RT-PCR扩增标志物是关键之处。角蛋白家族(CK)及多形上皮细胞粘蛋白(p

4、olymorphicepothelialmucin)是目前研究较多的胃癌微转移肿瘤标志物［2］,二者都在上皮来源的恶性肿瘤中有表达。CK-19作为细胞角蛋白家族的一种主要分布于上皮组织内，是构成细胞骨架的中间微丝M,具已被认为是检测循环癌细胞的敏感标志物⑷。MUC-1是多形上皮细胞黏蛋白(polymorphicepothelialmucin)的核心蛋白基因，已有人将其应用于RT-PCR检测乳腺癌细胞淋巴结微转移［5］。本研究用荧光定量RT-QPCR方法探讨早期胃癌患者外周血CK-19mRNA及MUC-1mRNA的表达的意义。1材料与方法1.1标本采集和保存采集陕

5、西省安康市中心医院2009年3月〜2012年3月期间住院的96例初治胃癌患者，男56例，女40例；腺癌37例，鳞癌23例，腺鳞癌21例，其他类型15例；年龄>60岁71例，W60岁25例；分期期13例,lb期24例，II期59例；并采集30例胃良性疾病患者和30例健康人的外周血作为对照组。比较三组人群在年龄、病理类型、性别和原发部位筹一般情况，其差异不存在统计学意义(上述4个因索均P>0.05,表2)。胃腺癌MGC-803细胞株为木单位保存。血液标木均为空腹外周静脉血，负压抽取，并弃首1mL,以防上皮细胞污染标本，后抽取约1mL外周血标本（肝素抗凝）。将血液标本

6、和对照细胞抽提总R7A后逆转录成cDNA分成2份，于-20°C冻存保存，在6个月内进行下一步的RT-PCR反应。1.2实验方法1.2.1外周血总RNA的抽提外周血中总RNA用吸附柱抽提后，通过紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶凝胶电泳检测RNA,确定其浓度、纯度及完整性。由Genebank中查得相应序列，并查阅相关文献[6-7],设计CK-19inRNA及MUC-1mRNA的引物,3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内参照引物，由Takara生物科技公司合成，序列如下：CK-19mRNA（正义链）：5'-AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3'；CK-19mR

7、NA（反义链）：5'-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3'；扩增片段460bp；MUC-lmRNA（正义链）：5'-ATGCCAGTAGCACTCACCATAG-3；MUCTmRNA（反义链）：5'-CAGCCAAGGCAATGAGATAGAC-3'；扩增片段510bp；GAPDH（正义链）:5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；GAPDH（反义链）：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；扩增片段452bp。为保证本部分实验筛选出的标本能够符合RT-QPCR实验的要求，本部分用于RT-PCR与RT-QPCR实验使用的引物序列

8、应保持一致，1.2.2c