微生物发酵综述.doc

《微生物发酵综述.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、微生物发酵综述以PCR为基础的微生物检测技术研究进展专业：生物技术学号:00811098姓名：何沂芳指导老师：苑琳完成时间：2010/6/8以PCR为基础的微生物检测技术研究进展摘要：PCR技术以其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，广泛地应用在微生物检测的各个领域。介绍了几种PCRj检测技术的方法及原理，以及在一些方面的应用。微生物检测PCR聚合酶链反应(polymemsechainreaction,PCR)技术是1985年由saiki首次提岀的，因为其有高灵敏性，特异性及简便易行等特点，该技术很快成为医学临床及生命科学研究的热点技术。长期以来，定

2、性检测技术虽然得到不断的改进和完善，达到了检测单个靶序列的水平，但在实际丁•作中，研究者们已不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。所以，借助PCR对基因快速，敏感，特异而准确的定量成为冃前研究的热点。而近年来出现的核酸定量PCR技术，尤其是在1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的实时(real一time)荧光定量PCR(fluorescentquantitativePCR,FQ—PCR)技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且与传统定量PCR技术相比，它具有许多优点。1PCR技术的原理PCR技术

3、是利用DNA聚合酶具有的以单链DNA为模板寡聚核昔酸为引物,沿5''方向渗入单核昔酸的特性，在体外适宜条件下扩增位丁•两段已知序列Z间的DNA区段。在DNA聚合酶催化的一系列反应中，两段序列不相同的引物分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，进行PCR反应时，摩尔数大大过量的引物及四种脱氧核糖核昔酸(dNTP)参与下对模板DNA加热变性，然后将反应物冷却至某一温度，在这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。重复进行变性、退火和DNA延伸这一循环,前一轮扩增的产物乂充当下一轮扩增的模板，冃的DNA以25方式积累，使皮克(pg)水平

4、的起始物达到ug数量级。1以PCR为基础的检测技术的特点进行PCR反应的基础是一•般至少知道冃标DNA片段的部分序列，PCR能在微生物检测中应用的关键是能根据这些序列设计高特异性的引物，这也意味着被测样品的DNA有保守或特异的序列。合成与这些序列互补的引物后，通过PCR反应，就能获得待鉴定的微生物的特异序列，从而证明该微生物的存在。2.1所需原料简单基丁PCR反应进行微生物检测的优点是不需要进行微生物的培养，只要能获得样品中的DNA,就能进行检测，即使样品中冃标DNA含量很低，也能用PCR的方法扩增出来。2.2检测时间很短检测时间很短，大约儿个小时即可获得结果，或不

5、超过24h。耐甲氧西林的金黄色衙萄球菌（MRSA）是医院中一种重要的感染性革兰阳性细菌，对多种抗生索具有抗性，因此对该菌进行快速诊断非常重要。表1是用传统和PCR技术检测MRSA的比较。从表中可以看岀，传统方法检测该菌至少需要4d,而基于PCR的技术只需耍ldo表1传统和基于PCR方法检测MRSA的方法的比较时间传统方法基于PCR的方法第0天棉拭子取样，增菌培养基接种，培养棉拭子取样，増菌培养基接种第1天从増菌培养液屮取菌液涂布选择性培养基，培养PCR检测，结果报告第2天检査培养基，继续培养第3天确证实验，结果报告，包括进一步的检测，如抗性检测等第4天继续培养观察，

6、结果报告2.3灵敏性光谱技术和计算机技术的联合使用，大大提高了检测的灵敏度，甚至可以检测到单拷贝的基因，这是常规PCR难以做到的。2.4精确性由TPCR的平台效应，传统PCR不能进行精确的定量，而实时荧光定量PCR不受扩增效率和试剂损耗的影响，利用扩增进入指数增长期的Ct值来定量起始模板量，实现了极为精确的核酸定量检测。2.5特异性荧光探针是针对靶序列设计，相当于在PCR的过程中自动完成了Southenl杂交，具有高特异性。2.6安全性常规的PCR在扩增结束后需耍琼脂糖凝胶电泳和混化乙锭(EB)染色。在紫外光下观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，除了有污染外

7、，还对人体产生一定的伤害。实时荧光定量PCR是在全封闭状态下实现扩增和产物分析的，降低了漠化乙锭的污染，有效地减少了污染及对人体的伤害，而且同时检测多个样品，有效减少了劳动量。2.7动态性实时荧光定量PCR可以在PCR反应的同时，检测反应的进程，实现了实时动态监测。2.8不足Z处多PCR也有不足Z处，如技术要求高，价格比较贵，污染风险大，易岀现假阴性或假阳性结果，需要严格的质量控制等。1几种基于PCR的检测技术3.1常规PCR检测常规PCR检测原理是在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液和MgCl,溶液的反应混合物屮，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡