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《双歧杆菌联合顺铂对黑色素瘤小鼠的治疗作用及机制.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、双歧杆菌联合顺钳对黑色素瘤小鼠的治疗作用及机制【摘要】目的：探讨双歧杆菌、顺钳及二者联合对黑色素瘤小鼠的抑瘤作用及其机制•方法：建立黑色素瘤荷瘤小鼠模型，分别以皮下及腹腔注射双歧杆菌和顺钳，处死小鼠后测瘤质量计算抑瘤率，病理切片后HE染色观察瘤组织及瘤细胞变化，流式细胞仪测瘤细胞周期,MTT法测小鼠淋巴细胞活性,CD3,CD4,CD8双荧光标记法测小鼠T细胞亚群变化•结果:注射1X1010cfu/L的双歧杆菌其抑瘤率可达54.0%,与顺钳组相似，与顺钳联合作用后其抑瘤作用更强，达74.4%；病理切片显示双歧杆菌抑制瘤细胞生长，且加强了顺钳杀伤瘤细胞的作用
2、;流式细胞仪检测结果显示：双歧杆菌作用后瘤细胞生长阻滞于G1期,顺钳作用后瘤细胞生长阻滞丁S期；双歧杆菌作用后小鼠细胞免疫功能增强，主要表现为CD4+比例增加，与正常组比较差异有统计学意义(P<；o.01).结论：双歧杆菌联合顺钳对黑色素瘤小鼠具有较强的抑瘤作用，其机制与抑制瘤细胞生长及增强小鼠细胞免疫功能有关.【关键词】双歧杆菌顺钳荷瘤小鼠抗肿瘤药0引言恶性黑色素瘤是一种好发于皮肤的高度恶性肿瘤，其对放疗与化疗均不敏感，这给晩期恶性黑素瘤的治疗带来一定的困难，双歧杆菌是一种生理性有益菌，且具有抗肿瘤作用［1-3］，但其对黑色素瘤的作用少见报道•我们
3、研究了双歧杆菌、顺钳及二者联合对黑色素瘤小鼠的抑瘤作用，观察了瘤组织及瘤细胞周期的变化、淋巴细胞增殖及T细胞亚群变化，旨在为双歧杆菌治疗恶性黑色素瘤提供新的理论依据.1材料和方法1.1材料C57/6J小鼠,6~8wk龄，雌雄不拘，体质量(16±2)g,中国科学院上海动物实验屮心提供•小鼠黑色素瘤B16细胞株，屮国科学院上海细胞生物学研究所提供•青春双歧杆菌菌苗(BF)由河南省医科院提供•顺钳为山东齐鲁药业产品,批号0504015.MTT,PI,DMS0购自Sigma公司；CD3FTTC,CD4PE,CD8PE荧光双标记mAb购自BD公司；RPMI1640
4、培养基、胎牛血清为TBD公司产品;全自动酶标仪(ThermoWultiskanAscent)；流式细胞仪(FACSCalibur)；倒置显微镜(Axioskop2plus).1・2方法1.2.1双歧杆菌的培养与计数采用PYG培养基培养，pH7.4的PBS洗涤3次,1500g离心15min,加ImLPBS,混匀,85°C水浴15min,细菌计数板计数•双歧杆菌浓度:16X1013cfu/L.1.2.2荷瘤小鼠模型的建立Bl6肿瘤细胞传两代以上，调整细胞数至3X1010/L,0.lmL/只接种于小鼠右后肢皮下,共注射30只，其余为正常对照.1.2.3分组共分
5、为6组：接种瘤株24h后的小鼠随机分成5组：I组为生理盐水组(即肿瘤对照组)，II组为顺钳组，III组为顺钳+高剂量细菌组，TV组为高剂量细菌组，V组为低剂量细菌组，VT组为未接种瘤细胞的正常对照组•注射方法为隔H注射1次，生理盐水和顺钳为腹腔注射,0.2mL/只，顺钳用量为4mg/kg,细菌组为多点皮下注射，0.ImL/只，IV组细菌浓度为lX1012cfu/L,V组细菌浓度为IX1010cfu/L.各组共注射7次，末次给药24h后处死小鼠.1.2.4检测指标1.2.4.1抑瘤率处死小鼠后剥瘤称瘤质量，计算抑瘤率•肿瘤抑制率(％)二对照组平均瘤质量-实
6、验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量X100%.1.2.4.2切片检查将瘤体浸泡于40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，制片，HE染色，光镜观察拍照.1.2.4.3瘤细胞周期检查无菌取瘤组织，切除坏死部分，匀浆，以PBS稀释成4X109个/L,750mL/L冷乙醇4°C固定・PT避光染色30min,流式细胞仪上分析细胞周期•每个数值为1X104个细胞的测定值.1.2.4.4淋巴细胞转化实验MTT法.无菌取脾，制备脾细胞悬液,台盼蓝染色观察活细胞数＞95%,调细胞数至6X109/L,加入96孔板，每孔100uL,各设6个复孔，放于37°C,50mL/LC02培养箱
7、中培养68h,加MTT液20uL,培养4h,离心1000r/min,lOmin弃上清，加DMSO液150UL,用微型振荡器振荡lOmin,使甲赞颗粒溶解,酶联免疫检测仪(570nm)测定各孔A值.1.2.4.5T细胞亚群的检测取4X109个/L的小鼠脾细胞悬液,PBS洗涤,待测管屮加入0.5mL的细胞悬液，分别加入CD3FITC,CD4PE,CD8PE抗体，振荡混匀，室温避光放置30min,PBS清洗，同上离心2次，计数1X104个细胞，上机检测细胞CD3,CD4,CD8阳性百分率，计算CD4+/CD8+比值.统计学处理:数据采用SPSS11.0软件进行
8、方差分析及Dunnnettt检验•结果以x±s表示.2结杲2.1双歧杆菌及顺钳对
