低产蛋白酶a啤酒酵母的选育及在啤酒中试酿造中的应用

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新疆农业大学硕士学位论文低产蛋白酶A啤酒酵母的选育及在啤酒中试酿造中的应用姓名：张卓申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：傅力;王德良20080501 摘要纯生啤酒泡沫稳定性是纯生啤酒质量保证的难题，啤酒酵母自身分泌的蛋白酶A是影响啤酒泡沫稳定性的关键物质。本论文采用诱变选育的方法筛选低产蛋白酶A的突变菌株，拟从根本上解决蛋白酶A对啤酒泡沫稳定性的影响。本研究采用了He—Ne激光，亚硝酸、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯(EMS)多种理化诱变方法，确定各种诱变方法的最佳实验条件并且比较了以上几种诱变方法的诱变效果。结果表明：连续使用亚硝基胍和EMS的诱变效果最好，筛选出10株突变株，其中5株菌株的荧光强度下降率大于15％；‘单独使用亚硝基胍和EMS诱变的效果次之，亚硝基胍诱变得到4株突变株，荧光强度下降大于10％的有2株，EMS诱变得到2株突变株，荧光强度的下降率均大于10％；亚硝酸诱变的效果再次之，得到的2株突变株，荧光强度下降率低于1096；激光诱变对筛选低蛋白酶A菌株无效果。对通过上述各种诱变方法选育出的18株突变株进行发酵性能及遗传稳定性实验，通过综合评价其发酵性能，双乙酰还原能力，异戊醇、异丁醇、正丙醇、乙酸乙酯等风味物质的含量、蛋白酶A活力及遗传稳定性能，最终得到一株发酵性能良好、蛋白酶A活力降低率高、遗传稳定性好的突变株GM235进行中试试验。中试试验表明突变株GM235在IOOL罐发酵9天，与出发菌株H相比突变株GM235的降糖能力、双乙酰还原能力略强，啤酒各项风味物质含量中正丙醇含量略高，异丁醇、异戊醇、活性戊醇、乙酸乙酯的含量均低于出发菌株，突变株GM235中试生产的啤酒泡沫更为细腻、持久。突变株的各项发酵性能均优于出发菌株H，且发酵终止时蛋白酶A活力明显低于出发菌株，酶活降低率为19．31％，具有很好的工业应用前景。关键词：啤酒酵母、蛋白酶A、诱变选育、中试研究 ABSTRACTThestabili付ofdraftbeerfoamisacriticalcharacterthatreflectsbeerquality．Althoughtherearem删，factofsthatPOsitivelyandnegativelyinfluencefoamstability，themostimportantnegative缸torisprotein猫eA．BrewingyeastexcretesproteinaseAintothewortduringfementation·ProteinaSeAdiminishesthehydrophobicityoffoam-positivepolypeptidesandreducesbeerfoamstability·The咖dymainly矗∞llses0nbreedingofbrewingyeastofthelowabilitytoexcreteproteinaseAduringwortfementation．M觚ymutagenesismethods，includingHe-Nelaserphysicsmutagenesis，andnitrite，NTG，EMSchemicaimutagenesis，wereusedandtheoptimalexperimentconditionswerestudied．T11emutatione骶ctsofcontinuoususedNTGandEMSwasthebestamongthesemutagens．ThenthecombinationNTGandEMSwere州andobtainedastraitr---GM235withgoodfermentationperformanceandlowproteaseAlever．GM235Wasappliedtoscaling-upfermentation．Thescaling-upfermentationshowedthatthefermentationperformanceandflavorofmutantGM235werebe做．rth锄origjnalstrain，andproteinasevitalityreducedby19．31％，underconditionsof100Lfermentorfor9days．Boththeabilityofdeclineofsugarconcentrationandreducingpowerofdiac2tylwereslightlystronger．N．propylalcoholwasslightlyhigher,whileisobutanol，isoamylalcohol，active锄ylalcohoIandacetidinthewerealllower．BeerfoamfrommutantGM235fermentationWasmoredelicateandlastedIongerthanoriginalstrain．ThemutantGM235isastrainwithgoodapplicationprospectinthebeerbrewing．Keywords：Saccharomycescerevisiae，proteaseA，Mutagenesisandbreeding,scaling-upf．e咖entationII 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：涨牟-时间：力略年∥月∥El关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：我阜导师签名：谗右时间：徊万年6月厂日时间：知D脾∥月乡日 新疆农业大学硕j|：学位论文第一章文献综述1．1国内外纯生啤酒发展概况啤酒是世界性饮料酒，历史悠久，很受广大消费者喜爱。这种传统产品随着科技进步、人民生活水平和文化水平的提高，以及消费意识和消费知识的增加而不断发展，越来越多的消费者追求健康时尚、口感新鲜、自然、卫生、安全营养、有益于健康的饮品，’纯生啤酒就是人们所喜欢的一种营养饮品。纯生啤酒利用低温膜过滤技术，在无菌条件下把发酵液中的酵母菌及其它可能的微生物全部过滤，然后在无菌操作环境中把啤酒灌装到经严格消毒灭菌的啤酒瓶中而生产的不经任何加热杀菌的无菌啤酒。纯生啤酒没有经过加热、未受到加热所导致啤酒加速氧化，保持了新鲜啤酒的营养成分和风味物质，因而纯生啤酒的口味更纯正、营养更丰富、更加受到消费者青睐。自从1967年日本Suntory采用Millipore大盘式膜过滤并用于纯生啤酒除菌过滤，成为全球第一家生产瓶装和听装纯生啤酒厂家，到1997年10月，日本Kirin所有生产线均采用膜过滤生产纯生啤酒，至此整个日本啤酒市场均为纯生啤酒。1996年，珠江啤酒集团公司根据对国内外啤酒市场和技术的了解，购买了国内第一条瓶装纯生啤酒生产线，结合珠江啤酒的工艺特点及产品特性，开发生产了瓶装无菌纯生啤酒系列，填补了国内这一啤酒品种的空白。近几年来，国内众多有实力啤酒企业纷纷进军“纯生市场"，这是中国啤酒业可喜的飞跃，它标志着中国啤酒业正走向风味稳定性竞争的新阶段，标志着中国啤酒酿造技术划时代的进步，拉近了我国与国外啤酒行业的距离。从啤酒行业产品创新的角度看，纯生啤酒己代表了我国啤酒业的发展方向。尽管我国内啤酒总产量连续四年位居世界第一，但是由于纯生啤酒的酿造是啤酒界的一次革命，从原料、工艺、设备均与传统酿造啤酒有着巨大的区别，突出的特点就是无菌酿造、设备价值昂贵、生产成本加大，因而纯生啤酒是高科技产品，也由于以上原因限制纯生啤酒在国内的进一步发展。与日本、美国、德国相比较，我们国内纯生占啤酒总产量的比例依然很小，日本啤酒基本都是纯生啤酒；啤酒故乡德国纯生啤酒产销量已占全部产销量的50％以上；美国纯生啤酒的市场份额则已经到了30％；2006年我国啤酒产量达到3500万吨，而纯生啤酒产量大约占啤酒总产量的5％。我国作为世界第一的啤酒生1 低产蛋白酶A酵母荫株的选育及中试酿造的研究l量皇罾曼曼舅曼曼!!曼!曼曼曼量产大国，随着整体技术装备和技术管理水平的不断提升，和人们生活水平的提高、消费观念的转变以及啤酒酿造技术的进步，纯生啤酒在啤酒总产量的比重将持续上升。1．2影响纯生啤酒质量的主要问题一纯生啤酒泡沫的稳定性啤酒的泡沫稳定性(foamstability)又称为啤酒的泡持性，即泡沫的存在时间，指啤酒注入杯中，自泡沫形成至泡沫崩溃所持续的时间。按照欧洲酿酒协会的定义，纯生啤酒泡沫的性能包括起泡性、泡沫稳定性、泡沫挂杯和泡沫的外观等密切相关的几个方面n1。因此纯生啤酒泡沫的质量是泡沫的稳定性、挂杯性、白皙度等一系列内在关联特性的总和。其中泡沫的稳定性是其他特征存在的前提和基础，是啤酒泡沫质量的关键。根据国家标准GB4927-2001的要求，优级纯生啤酒的泡持性应该大于200秒。当前纯生啤酒已经成为啤酒行业更新换代的方向性产品，同时作为啤酒企业的高科技产品，呈现出良好的发展态势。然而纯生啤酒泡沫稳定性方面却存在明显的缺陷，即随着货架时间的延长，啤酒泡沫稳定性逐渐下降(如图卜l所示)。纯生啤酒泡沫稳定性的衰减问题已经成为影响中国，乃至世界范围内纯生啤酒发展的最大障碍。与此同时由于其泡沫的衰减，影响消费者对产品的认可程度，影响啤酒生产企业的经济效益和社会效益，已经成为制约纯生啤酒发展的“瓶颈”。纯生啤酒泡沫的稳定性是当今世界纯生啤酒质量保证的难题，每两年一次的国际顶尖啤酒酿造大会一欧洲酿酒大会(EuropeanBreweryConvention)自90年代以来连续有一个部分专门关于啤酒泡沫稳定性的最新研究动态报道和讨论瞳1，因此如何提高纯生啤酒泡沫稳定性将成为啤酒行业及相关科研人员的研究热点。2250200仓150菱100赠500l2345678910111213时间(周)口纯生啤酒口普通啤酒图卜1同一批次纯生啤酒和普通啤酒贮藏期间的泡沫稳定性Fig．1一lFoamstabilitytrackingofpuredraftbeerandordinarybeerwiththesamebatch 薪疆农qk大学硕士学位论文1．3影响纯生啤酒泡沫的稳定性的主要因素一蛋白酶A影响啤酒泡沫稳定性的因素很多，包括蛋白酶A、蛋白质、类黑素、多糖、二氧化碳、异一Q一酸、金属离子、水、酒精等啤酒成分对泡沫均有影响口1。由于纯生啤酒生产工艺的特殊性，即与熟啤酒相比较纯生啤酒未经过巴氏杀菌，因此啤酒中残留的蛋白酶是造成纯生啤酒存放过程中泡沫衰减的一个主要因素。一般说来，啤酒酿造过程中蛋白酶主要有两个来源。其一是来源于麦芽，在大麦发芽时会有自然蛋白酶产生，它可以降解蛋白质产生足够的有泡沫稳定性的多肽；其二是来源于酵母，酵母含有多种蛋白酶，主要包括蛋白酶A、蛋白酶B，羧肽酶Y和S(CPY、CPS)、氨肽酶Co和氨肽酶I、二肽酰氨肽酶等H1。由于来自麦芽的蛋白酶经麦汁煮沸后即失去活性，因此不会对啤酒泡沫稳定性产生影响。来自酵母的蛋白酶根据其水解部位分为两大类，蛋白内切酶(蛋白酶A和蛋白酶B)和蛋白外切酶(羧肽酶和氨肽酶)。由于与泡沫有关的蛋白分子较大，分子量40k道尔顿的Z4蛋白、Z7蛋白和分子量为17k道尔顿的脂类转移蛋白乜1，因此作用于这些蛋白的酵母蛋白酶不会是仅能水解小分子量的蛋白外切酶。而蛋白酶B在pH=5左右时甚至在低于50*(2的温度下也极不稳定很快失去活性；并且羧肽酶及蛋白酶B的最适pH均偏碱性(pH>8)，在酸性条件下尤其是啤酒环境中(pH<4．5)这两种酶基本没有活性，因此对纯生啤酒泡沫产生影响的只可能是酵母蛋白酶A。随着研究手段提升和研究工作进一步深入，蛋白酶A对纯生啤酒泡沫稳定性的负面影响已被进一步证实睁131。大量的研究证实啤酒泡沫稳定性的变化是从酵母细胞的细胞膜渗漏处的胞内蛋白水解酶所引起的，不同啤酒中蛋白酶A含量见图卜2；尤其是在有压力条件下，这种蛋白酶从活酵母细胞中渗漏的观点，已被大多数人认同。与此同时在纯生啤酒储藏前期，泡沫的衰减主要是由于蛋白酶A所导致的，在储藏后期，啤酒泡沫稳定性的衰减主要由蛋白酶A的前驱物所导致n41。 低产蛋6酶A酵母菌株的选育及中试酿造的研究。昌＼≥o．R鹕《避．Ⅱ裔蕾。彳菌0．幽．。i．ii．1。冒．圉．圄．0二9．雷：羹冒。6豳3．图．Y．幽．。i．i．冒．1ABCDEF6ItIJKLMN0Pq不同品牌啤酒图1-2各种不同市场销售的啤酒中蛋白酶^活力Fig．1-2BeerproteinaseAvitalityfromdifferentmarket图中字母代码为A～J为日本的品牌K与L为德国品牌M为丹麦品牌N-．一p为美国品牌Q为中国品牌F为热杀菌啤酒J与L为含酵母的啤酒D、E、P为冰啤酒。1．4酵母蛋白酶A的研究概况早在二十世纪之前人们就已在酵母中发现了蛋白酶，在二十世纪二十年代开始对酶特性进行了研究。在二十世纪七十年代，发现了八种酵母蛋白酶：蛋白酶A和B，羧肽酶Y和S，三种氨基肽酶和一个单一的二肽酶。在八十年代中期，由于生色底物测定技术的发展，已知的酵母蛋白酶数量已增加到约40种n钉。蛋白酶A是酵母中第一个受到研究的酶，它是一种酸性蛋白酶，其特性与哺乳动物猪胃蛋白酶、组织蛋白酶D和E以及人的血管紧张肽原酶相似n引，由于这些酶氨基酸数目大约为327，并且序列同缘性都大于40％，活性中心保守序列Asp33_-Thrqly—Ser及Asp218-_Thr—G1y—Ser中天冬氨酸侧链参与了催化作用，因此这几种酶都叫做天冬氨酸蛋白酶Ⅱ71。蛋白酶A能催化细胞内蛋白质水解，特别是在氮缺乏、孢子形成时，蛋白酶A通过水解蛋白质为孢子，新蛋白合成提供氨基酸来源n刀。在液泡中，酵母蛋白酶A参与多种酶的转录后加工。通过对蛋白酶A编码基因PEP4突变体(如插入突变、无义突变、错义突变)的研究n螂1发现，酵母蛋白酶A不仅参与自身的加工成熟过程，还参与液泡中其它液泡酶的成熟激活过程，如蛋白酶B前体及其酶原被蛋白酶A切割后进一步对羧肽酶Y前体进行加工，蛋白酶A也可以直接切割羧肽酶Y前体并使其成熟。另外，氨肽酶I、核糖核酸酶、碱性磷酸酶、海藻糖酶的成熟激活都与蛋白酶A有关n羽。基4∞；乌∞历幻惦m50 新疆农业大学硕．卜学位论文!Ill量曼篡曼曼曼曼鼍量曼曼量曼曼曼曼蔓皇笪曼曼舅曼量量曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼笪曼曼曼曼曼曼笪曼!曼曼曼曼曼曼曼曼曼!曼曼曼曼曼蔓皇!!曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量于蛋白酶A对其它酶原前体的激活作用，因此对于正常的酵母细胞生长代谢而言，蛋白酶A是必不可少的。一些啤酒研究人员认为液泡中蛋白酶A并非由活酵母细胞中分泌出来的，而是由于酵母细胞自溶所释放出来。然而根据Maddox与Hough证明：通过活酵母细胞释放出细胞内水解酶——蛋白酶A，活细胞释放蛋白酶A部分原因是由于发酵过程的压力所导致晗11。在正常代谢途径下，蛋白酶A酶原应该按照指定的途径从高尔基体输送到液泡中，而酵母在逆境条件下，如发酵条件下，通过一些错误的途径，蛋白酶A酶原从酵母活细胞内输送到胞外乜幻。图1-3显示了活酵母向胞外释放蛋白酶A的机理。赢尔基体◆【lC，雨r■—■≥：=j细胞膜蛋白酶A酶原C，fr——_一蛋白酶A活化形式陌#竺蛋白酶A的酶原图1-3酵母细胞分泌蛋白酶A到胞外和降解泡沫活性蛋白的模式图Fig．1·3theschemeofyeastcellexcretesproteaseAwhichdegradethefoamactiveproteininextracellular所有酵母液泡内酶原的活化取决于蛋白酶A，而蛋白酶A本身也是以酶原的形式合成。这个405个氨基酸的前驱物经输送到内质网时，进行糖基化，其中22个疏水性氨基酸被水解脱落；而转运经过高尔基体复合体时，酶原的碳链端受到修正，同时前驱物产生一个大约50kDa的酶原前体形式(proPrA)；当酶原前体形式由内涵体进入液泡时，切除掉54个氨基酸而产生一个分子量为42kD的成熟蛋白酶。以前的研究表明：蛋白酶A能够自动活化，然而这个蛋白酶A的酶原的活化大体上与其它已知的蛋白酶酶原活化没有相似性。为了研究为什么蛋白酶A的活化在液泡中出现如此之快，而不是在前期阶段，研究人员将该酶原纯化后研究导致自动活化与活化的相应机理的条件；结果表明自动活化是由于酸性pH所诱发，其活化速率随着离子强度的增加而增加。动力学的数据证明：自动活化主要通过一个双分子的产物催化机理而进行的，即一个蛋白酶A分子催化一个酶原分子；上述的自动活化由酸性pH所诱发与离子强度的依赖性以及产物催化机理在体内同样适应。因为在缺乏蛋白酶A的条件下，缓慢的活化有助于阻止酶原到液泡前的活化。然而，酶原到液泡后，酸性pH、高离子强度和已经存在5 低产蛋n酶A酵母菌抹的选育及中试酿造的研究!mo!m,m量曼曼鼍曼曼曼曼量曼曼曼皇舅量曼的活性蛋白酶A大大加速了酶原的活化。催化的自动活化可能是通用的机理∞1。1．5降低蛋白酶A活力提高纯生啤酒泡沫稳定性研究进展酵母分泌的蛋白酶以及对泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴趣，尤其在国内纯生啤酒超高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A的活性问题更引起人们重视。既然蛋白酶A活性对啤酒泡沫稳定性影响巨大，通常可以考虑通过以下三种途径来降低蛋白酶A的影响n引，提高纯生啤酒泡沫稳定性：第一种途径是限制酶的产生和分泌。长时间以来，酵母研究者否认活性酵母会分泌蛋白水解酶，认为该酶的存在仅是酵母自溶的一个反映。进一步的研究证实，释放至啤酒中的蛋白酶的量与酵母的活力有关，而不仅仅是自溶的酵母才释放蛋白酶A。低活力的酵母可产生高浓度的蛋白酶A，意味着啤酒的泡沫质量差，这就要求在实际生产中人们应在啤酒成熟后立即将酵母从酒液中分离出来。Kondo等瞵1建议降糖结束后立即用离心的方法分离酵母，并将上清酒液降至冷储温度(T：A颠换而导致突变。烷化剂的作用还可引起DNA分子中磷酸和糖之间的共价键断裂，而造成突变。H71亚硝基胍是一种非常有效的诱变剂，素有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，具有较好的诱变效果。张搏润陌朝等采用硫酸--K,酯和亚硝基胍对酵母菌进行诱变，24 耨秘农业大学硕十学位论文共得到32株营养缺陷型菌株，致死率为99．5％，诱变率为1．7％，诱变效果良好。石贵阳脚1以啤酒酵母为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍处理后，得到两株可应用于大容积发酵罐絮凝性较好的突变株株。CayoRamos等侣L删通过亚硝基胍诱变啤酒酵母，获得一株抗苏氨酸酵母菌株，并可以应用于工业生产。这些都说明亚硝基胍的确实有较强的诱变作用，在啤酒酵母诱变选育研究中作为诱变剂大量使用。2．5．4EMS诱变EMS也属于烷化剂，所以其诱变作用机理与亚硝基胍类似。EMS有强烈倾向去乙酰化鸟嘌呤并且对第七位上的腺嘌呤也有作用。在下一步的复制中由于乙基化的碱基不仅容易被其他碱基对取代，而且能自发的脱离DNA丝，因而造成了嘌呤缺口。在下一步复制中将会插入一个错误的碱基，因而造成一个遗传性的碱基对的取代。洲HaruoMomose等砸¨利用EMS诱变酿酒酵母Saccharomycescerevisiae产生变异多产蛋氨酸的菌株。SusanAHenry等隋21对酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae采用EMS诱变，脂肪酸饥饿培养的方法，可以出选育抗药、温度敏感、营养缺陷型酵母菌株。通过EMS诱变，从啤酒酿造生产菌株中筛选分离得到一株发酵液中双乙酰含量优于亲株的新菌株，其双乙酰含量比亲株降低了42．7％，该菌株的其它发酵性能的测定结果表明其保持了亲株的优良性状，且遗传性状稳定嘟1。2．6本章小结(1)He-Ne激光诱变，无论是滤纸片法还是试管法，对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株没有效果，所以He-Ne激光诱变不适用于选育低产蛋白酶A的突变株。(2)亚硝酸诱变酵母菌株的最佳条件是：0．1mol／L亚硝酸钠，使用pH4．5、lmol／L醋酸缓冲液稀释，亚硝酸钠最终浓度0．025mol／L，诱变处理lOmin。得到2株突变株NL30和NL38蛋白酶A活力较出发菌株低，荧光强度的下降率分别为9．30％和7．10％。(3)亚硝基胍诱变酵母菌株的最佳条件是：用0．2mol／L磷酸缓冲液(pH6．0)溶解，亚硝基胍最终浓度为lmg／mL，处理20rain。得到4株突变株GH45、GH46、GH65、GH69的蛋白酶A活力较出发菌株低，荧光强度的下降率分别为15．88％、10．00％、8．56％ 低产蛋白酶A酹母荫株冉勺逸胃及中试限透的研究和2．81％。(4)EMS诱变酵母菌株的最佳条件是：诱变最终浓度最终浓度30“L／mL，诱变处理30min。得到突变株EH78和EH88蛋白酶A活力较出发菌株低，荧光强度下降率分别为13．97％和20．65％。(5)连续采用亚硝基胍和EMS诱变对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株有很好的效果，有10株突变株GM05、GMIO、GMl5、GM96、GMl61、GMl69、GM201、GM235、GM237、GM239蛋白酶A活力较低，荧光强度的下降率分别为：20．39％、18．66％、18．16％、18．87％、12．18％、14．14％、6．54％、6．27％、7．94％和19．83％。(6)比较这几种诱变方法的诱变效果发现，连续使用亚硝基胍和EMS的诱变效果最好，筛选出lO株突变株，其中7株菌株的荧光强度下降率大于10％，有5株菌株的荧光强度下降率大于15％；单独使用亚硝基胍和EMS诱变的效果次之，亚硝基胍诱变得到4株突变株，荧光强度下降大于10％的有2株，EMS诱变得到2株突变株，荧光强度的下降率均大于10％；亚硝酸诱变的效果再次之，得到的2株突变株，荧光强度下降率低于10％；激光诱变对筛选低蛋白酶A菌株无效果。 新疆农娩大学硕+学位论文第三章低产蛋白酶A突变株初筛方法的确定3一前言本实验采用两种初筛方法进行筛选一羧肽酶Y平板鉴定实验和酸变性血红蛋白平板实验，通过两种方法的筛选效果进行比较分析，得出操作简单有效，筛选分辨率高的实验方法作为该研究合适初筛方法。3．2材料、试剂及仪器3．2．1培养基液体培养基、完全培养基(YPD)，同前。甘油培养基：2％甘油，2％蛋白胨，1％酵母浸粉，2％琼脂。3．2．2实验试剂本章实验主要试剂见表3一l。表3-1主要试剂Tab．3·1Mainexperimentalreagents3．2．2实验仪器本章实验主要仪器见表3-2。 低产蛋r|酶A酵母甍拣的选育及中试酿造的研究表3-2主要仪器Tab3-2Mainexperimentalinstrument仪器名称产地AEL-160电子分析天平220V／2000W万用电炉LDZX．50KBS立式电热压力蒸汽灭菌器洁净工作台pHS_3C精密pH计SHZ．82恒温振荡器LRH-150B生化培养箱BCD．270GTNS三星冰箱微量取样器(1ml’，2001JL，209L)SHIMADZUJapan上海甲光仪器仪表有限公司上海申安医疗器械厂北京半导体设备一厂上海雷磁金坊市富华仪器有限公司广东省医疗器械厂三星电子中国代理服务部GII，SoNFrance3．2．3主要试剂的配制(1)涂盖液(用于一个平板的量)：用玻璃或聚丙烯试管，取2．5mL的lmg／mLN一乙酰一DL一苯丙氨酸一B一萘酯(溶在二甲基甲酰胺中)与4mL的0．6％熔化琼脂混合，50℃保温。(2)5mg／mLFastGarnetGBC(石榴红硫酸盐)：将GBC溶在0．1mol／LTris—HCI(pH7．4)中，现用现配。3．3实验方法3．3．1羧肽酶Y平板鉴定实验(1)在YPD平板上培养菌落，28℃培养2"-3天，菌落可见；(2)小心把涂盖液加在平板表面使之完全覆盖细胞；(3)待琼脂凝固5-'-10min后，小心用新鲜FastGarnetGBC溶液冲刷表面；(4)显色5min后，野生型菌株将变红，而羧肽酶Y缺陷菌株将呈黄色或粉红色；(5)倒出FastGarnetGBC溶液以便更好的观察颜色变化。嘲3．3．2．酸变性血红蛋白平板实验(1)将诱变菌液涂布于YPD，每板约100个菌落，28。C培养2～3天，菌落可 新疆农业大学硕士学位论文见；(2)转移至甘油平板培养3---,4天，激活蛋白酶A酶活；(3)将lOmL覆盖液(2％琼脂，0．3％酸变性血色蛋白pH=3，0．05M磷酸二氢钾pH=4．5，0．22％TritonX一100)均匀倒于平板，30℃放置2～3天；(4)每平板加入l～2mL10％三氯醋酸平铺，没有水解圈的菌落缺乏水解血红蛋白能力，根据水解圈的大小评估其水解酸变性血色蛋白的能力。№633．4结果与分析对两种筛选实验的效果进行比较，羧肽酶Y平板染色效果如图3-1，酸变性血红蛋白平板光圈的形状如图3—2。由图可以看出，羧肽酶Y平板上红色与粉色菌落肉眼非常难以辨别，且其染色深浅还受所倒平板厚度干扰，染色结果不便于观察；而通过酸变性血红蛋白平板实验，根据水解圈的大小来判断菌株蛋白酶A活力强弱，效果比较明显。图3-1羧肽酶Y平板染色结果Fig．3—1TheresultofcarboxypeptidaseYplate图3-2酸变性血红蛋白平板结果Fig．3-2Theresultofacid-denaturedhemoglobinplate 3．5讨论酵母蛋白酶A(PrA)能自身加工成熟，所有液泡水解蛋白酶活性的激活都依赖于蛋白酶A活性，如羧肽酶(CPY)和蛋白酶B(PrB)都是典型的蛋白酶A依赖型水解酶。羧肽酶为酵母PRCI基因编码，在细胞中首先合成532个氨基酸的前蛋白酶原，进入内质网切去20个氨基酸的信号肽并在四个位点进行糖基化，生成pl—CPY，pl—CPY在高尔基体中进一步修饰生成p2-CPY约69kDa(proCPY)，hindu液泡，被蛋白酶A切去N端91个氨基酸残基，形成活性酶体，最后被蛋白酶B进一步力n-r．，生成完全成熟构型的羧肽酶分子M。蛋白酶B与蛋白酶A是目前发现的两种液泡水解蛋白酶内切酶，涉及酵母体内糖质新生途径，激活生长途径的关键酶如壳质合成酶嘲1。蛋白酶B也参与液泡酶的活化，但并不认为是必须的，主要是对蛋白酶A、羧肽酶成熟的最后一步进行修饰，生成完全成熟构型的酶分子，在蛋白酶B缺陷菌株中蛋白酶A、羧肽酶酶体比完全成熟构型的酶分子多几个额外的氨基酸，但是催化活性并不受影响。鼍璺I一=兰b吒匕竺兰==竺bP竺．．CoYIo‘。。’--。-__-·_-。_‘。。1。o·_。一k^___-______-··J_·___-_-_·-___·_LJUl旨置譬三雪主30厂proh^mPr8proC“11^人‘一。b1_戈1’一人人人^。岫予IⅦL人．I√～—、—、口—、人口一、口—、口图3—3PrA、CPY与PrB关系Fig．3-3TherelationshipofPrA，CPYandPrB 新疆农业大学硕t学{奇论文蛋白酶A缺陷菌株有三类表型：(1)PrA—PrB+Cpy+、(2)PrA—PrB—Cpy+、(3)PrA—PrB—Cpy一[24]o前两类羧肽酶表现为有催化活力，但是羧肽酶的活化依赖于蛋白酶A，说明此两种表型突变株在体内有一定的蛋白酶A活力保证羧肽酶前体被加工成熟，但是在突变株中蛋白酶A因为未知的因素导致其在体外没有活性或者很快被降解掉，所以无法检测到表现为PrA’；第三种表型可以认为蛋白酶A缺陷菌株完全失去蛋白酶A活力。基于上述观点，可以认为通过检测酵母羧肽酶活力可以间接筛选到蛋白酶A缺陷菌株。通过观察菌落颜色，可以判断颜色浅或者粉色菌落为(1)或者(2)型，因为此两种突变菌株虽然在体内有一定的蛋白酶A活力保证羧肽酶前体被加工成熟，但是与野生型(红色)比较，应表现为弱势；无色(黄色)菌落可以判断为(3)型，即体内蛋白酶A完全失活。研究表明，蛋白酶A功能缺失细胞，大量的液泡酶功能缺失，细胞在贫营养或者孢子形成时蛋白质降解水平显著下降，氨基酸供应不足，PrA-，PrB一还会导致细胞死亡率上升，所以选育蛋白酶A缺陷菌株时，应著眼于筛选(1)或者(2)型缺陷菌株，在保证其他酶活力，细胞正常功能的同时，尽可能确保胞外蛋白酶A低水平、低活力。但从羧肽酶Y平板实验的实际操作效果来看，未出现过无色(黄色)菌落，用肉眼观察染色平板上的红色与浅红或粉色菌落很难区分，且其染色深浅还受所倒平板厚度干扰，结果不好观察；筛选的105株突变株中，有42株不能完成三角瓶发酵实验，由此推测，从染色平板上挑选出的颜色较浅的菌落也有可能是经过诱变后影响了发酵性能的菌株而表现出的。蛋白酶A是酵母中目前所知道的唯一在酸性pH范围水解酸变性血色素(acid—denaturedhemoglobin)的酶嘲1，所以采用酸变性血红蛋白平板进行筛选，可以判定蛋白酶A的存在与否及活力高低。3．6本章小结酸变性血红蛋白平板实验是诱变选育低产蛋白酶A菌株的最佳初筛方法。 新疆农业夫学硕。j二学位论文4．1前言第四章突变菌株的发酵性能实验及中试试验实验通过对选育出低产蛋白酶A活力的突变株进行发酵性能、低蛋白酶A活力遗传稳定性等研究从而确定最佳的目的菌株，并对筛选出的最佳目的菌株进行中试酿造实验，评价其实用价值。4．2材料、试剂及仪器4．2．1实验材料与试剂本章主要实验材料与试剂见表4—1。表4-1主要材料与试剂Tab．4—1Mainexperimentalmaterialsandexperimentalreagents名称纯度等级产地澳麦麦芽苦花(青岛苦花)Saaz香花邻苯二胺盐酸正丙醇磷酸氢二钾柠檬酸Brij—’35荧光底物MOCAc-Ala—Pro-Ala-Lys—Phe—Phe叫bg—leu(Dnp)-Nhz分析纯色谱纯分析纯生化试剂保定麦芽厂青岛新疆北京市兴津化工厂北京化学试剂公司Sigma北京化学试剂公司BioBasiclnc日本PeptideInstitute二甲基亚砜生化试剂amResco氯化钙分析纯北京化学试剂公司甲醛分析纯北京化学试剂公司磷酸分析纯北京化学试剂公司 低产蛋白酶A酵母菌株的选育及巾试酿造的研究4．2．2主要仪器本章实验主要仪器见表4—2。表4-2主要仪器Tab．4—2Mainexperimentalinstrument仪器名称产地AEL一160电子分析天平唧．SYl1一Ni电热恒温水浴锅双乙酸蒸馏器|lV-2401PC分光光度仪A|ItosystemXL气相色谱仪F-2500荧光分光光度计pHS一3C精密pH计SHZ一82恒温振荡器MVS一1漩涡混合器KQ-100DE型医用数控超声波清洗器101-1型电热鼓风干燥箱LRH一150B生化培养箱BCD-270GTNS三星冰箱微量取样器(Iml，200肛L，20“L)糖锤度计糖化锅100L发酵罐SHIMADZUJapan北京长风仪器仪表公司北京SHIⅣ【ADZuPerkinELmer日立上海雷磁金坊市富华仪器有限公司北京东方开物科学器材有限公司昆山市超声仪器有限公司江苏省东台县电器厂广东省医疗器械厂三星电子中国代理服务部GILSONFrance河北省河间县仪表厂BAM4．2．3主要试剂的配制(1)109／L邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺0．1009，溶于4mol／L盐酸溶液中，并定容至10mL，摇匀，放于暗处。此溶液须当天配制与使用；若配制出来的呈红色，应重新更换新试剂。(2)pH5．3磷酸氢二钾一柠檬酸缓冲液：A液：0．2MNa2HPq，称取7．16289Na2HP0,·12H20或3．12029Na2HPO,·2H20溶于水中，并定容至100IIlL；B液：O．1M柠檬酸，称取2．10149柠檬酸溶于水中，并定容至100mL；用B液调节A液pH值至5．3-5．5，按0．005％的比例加入Brij-35。 新疆农业大学硕f：学位论文4．3实验方法4．3．1突变菌株的发酵性能实验4．3．1．1三角瓶发酵实验(1)分别挑取斜面低温保藏的上述试验选育的低产蛋白酶A活力突变株共18株菌株各1环；(2)在YPD培养基上，划线分离出单菌落，28"C培养2---3天；(3)在180x18的试管加入lOmL无菌麦汁，接入1个单菌落，28"C培养48h；(4)在500mL三角瓶装中入300mL的无菌麦汁，将活化好的小试管菌液接种与大三角瓶中，用发酵栓密封，12"C培养9天，每天称取瓶重，记录每日失重量，当日称重失重在0．2克以内表明发酵结束，检测双乙酰还原能力、风味物质含量和蛋白酶A活力。4．3．1．2发酵力的测定以每天的二氧化碳失重量计算出总失重量来衡量发酵力。4．3．1．3双乙酰含量的测定用蒸汽将双乙酰蒸馏出来，与邻苯二胺反应，生成2，3一二甲基喹喔琳，在波长335nm下测其吸光度。由于其他联二酮类都具有相同的反应特性，另外蒸馏过程中部分前驱体要转化成联二酮，因此测定结果为总联二酮含量(以双乙酰表示)。(1)将双乙酸蒸馏器安装好，加热蒸汽发生瓶至沸腾。通蒸汽预热后，置25mL容量瓶于冷凝器出口接受馏出液(外加冰浴)，加1～2滴消泡剂于lOOmL量筒中，再注入未经除气的预先冷至5"C左右的酒样lOOmL，迅速转移至蒸馏器内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞，然后用水密封，进行蒸馏，直至馏出液接近25mL(蒸馏需在3min内完成)时取下容量瓶，达到室温后用重蒸水定容，摇匀；(2)分别吸取馏出液10．OmL于两支干燥的比色管中，并于第一支管中加入邻苯二胺溶液0．50mL，第二支试管中不加(作空白)，充分摇匀后，同时置于暗处放置20"--30min，然后第一支管中加4mol／L盐酸溶液2mL，第二支管中加入4mol／L盐酸溶液 低产蛋fi酶A酵母菌株的选育及巾试酿造的研究!!i————!ii量曼曼舅曼曼量曼曼曼舅舅曼曼曼曼曼皇曼曼曼量曼曼曼曼皇曼2．5mL，混匀后，用20mm玻璃比色皿(或lOmm石英比色皿)，于波长335nm下，以空白作参比，测定其吸光度(比色测定操作须在20min内完成)；(3)试样的双乙酰含量按下式计算：X=A335×1．2式中X一试样的双乙酰含量，mg／L；A∞。一试样在335nm波长下，用20nm比色皿测得的吸光度；1．2一吸光度与双乙酰含量的换算系数。注：如用lOmm的石英比色皿测吸光度，则换算系数应为2．4。4．3．i．4风味物质(醇、酯类物质)含量的测定采用气相色谱法测定发酵液的风味物质含量的原理：试样进入气相色谱仪中的色谱柱时，由于在气固两相中的吸附系数不同，而使乙醇与其他组分得以分离，利用氢火焰离子化检测器进行鉴定，与标样对照，根据保留时间定性，利用内标法定量。色谱柱与色谱条件如下：毛细柱：PEG2M0．25minx30m(SGE)；固定相：Chrornosorbl03，60～80目；柱温：50℃；气化室和检测器温度：240℃；载气(高纯氮)流量：40mL／mim氢气流量：30mL／min；空气流量：400mL／min；顶空进样：lmL：实验过程如下：(1)啤酒经过离心、过滤除去酵母菌体；(2)将5mL啤酒装入20mL顶空瓶中，加入100pL(色谱纯)正丙醇作内标，盖上胶塞，用铝制瓶塞密封；(3)自动进样，结果分析：用试样的峰面积与内标峰面积的比值(或峰高比值)，查工作曲线，或使用回归方程计算出试样中各物质含量。 新疆农业大学硕卜学位论文4．3．1．5蛋白酶A活力测定具体实验方法同2．3．8，利用标准蛋白酶A做出酶活力与荧光强度的对应曲线，通过曲线可以读出对应的蛋白酶A活力。蛋白酶A活力降低率的计算：出发菌株酶活的相对值=出发菌株的酶活力值一空白酶活力值突变株酶活的相对值=突变株的酶活力值一空白酶活力值突变株酶活的降低率(％)=(出发菌株酶活的相对值一突变株酶活的相对值)／出发菌株酶活的相对值×100％4．3．1．6遗传稳定性选择发酵性能较好，蛋白酶A活力低的突变株转接到斜面上保存，挑取一环上述保存在麦汁斜面上的突变株培养物转接至新的麦汁斜面，共传5代，然后按照4．3．1．1的方法进行三角瓶发酵实验，通过发酵过程的总失重量、发酵终止液的双乙酰含量、主要风味物质含量和蛋白酶A活力，来评价突变株的遗传稳定性能。4．3．2突变菌株的中试试验4．3．2．1酵母扩大培养斜面一平皿划线一液体试管一小三角瓶一大三角瓶一发酵罐(1)挑取斜面低温保藏的出发菌株和最佳突变株菌种各1环；(2)在YPD培养基上，划线分离出单菌落，28"C，培养2—3天；(3)在180X18的试管加入lOmL无菌麦汁，接入1个单菌落，28"C培养48h；(4)在500mL的三角瓶装中入300mL的无菌麦汁，将活化好的试管菌液接种于大三角瓶中，28℃培养24h；(5)再将500mL的三角瓶中的300mL菌液接入2000mL的无菌麦汁中，28"C培养48h，最后接入发酵罐。4．3．2．2发酵工艺按照糖化工艺最终麦汁浓度为110P，最终定型麦汁IOOL。37 低声蛋白酶A酵母菊株的选育：受中试酿造的研究4．3．2．2．1配料单单产100升：用料16．Okg，用水60L。4．3．2．2．3发酵工艺(1)出发菌株与突变菌株的细胞数大致相等，酵母添加量10％，接种温度IO'C；(2)麦汁满罐后自然升温至11．O'C进行主酵(±O．2℃)；(3)当糖度降到3．8--．．4．20p时，开始升压且控制在0．08Mpa；(4)升压后排除酵母，以后根据实际情况每2、3天排一次直至滤酒；(5)当双乙酰降到≤0．08mg／L时，开始以0．3℃／h的速度降温至O'C。4．3．2．3中试发酵过程中糖度、酵母数、双乙酰还原能力的测定使用糖锤度计测定糖度：取一个250mL量筒，先以少量试样冲洗量筒内壁，洗毕弃去。然后盛满样液，静置，待样液内部空气逸出，泡沫浮上液面后，将泡沫除去。把锤度计抹干，用样液冲洗，然后徐徐插入筒中，当温度计正确表示样品的温度时，以水平视线按样液的真正液面高度读数，记下观测锤度，并记录当时的温度读数。查表校正成20℃时的数值。酵母数用血球计数板计数。双乙酰还原能力的测定同4．3．1．3。4．3．2．4中试发酵结束后发酵度和风味物质的测定真正(实际)发酵度的测定：发酵度代表着酵母的发酵能力，啤酒的真正发酵度可按下式计算。 新疆农业大学硕。t学位论文A×2．0665X100RDF=Er+A×2．0665式中RDF一啤酒的真正发酵度，％；A一啤酒的酒精度，％(m／m)；Er一啤酒的真正浓度，。P或％(m／m)。风味物质含量的测定4．3．1．4。4．3．2．5中试发酵过程中及发酵终止蛋白酶A活力的测定蛋白酶A活力测定同4．3．1．5。4．2．3．6泡沫综合指标的测定起泡力和泡沫形态当啤酒注入洁净透明的玻璃杯中，泡沫起发的强弱称为起泡力或叫起泡性。起泡力强的啤酒，在杯中应该会有1／2甚至2／3容量的泡沫存在，它的形态要求洁白、细腻、似奶油状为佳。泡沫持久性是采用秒表法，将玻璃杯置于铁架台底座上，固定铁环于距杯口3cm处。啤酒置15℃水浴中，保持至等温后启盖，立即置瓶口于铁环上，沿杯中心线，以均匀流速将啤酒注入杯中，直至泡沫高度与杯口相齐为止，同时按秒表计时，记录从泡沫初始至消失时间。泡沫附着力泡沫附着力即为泡沫挂杯现象，啤酒泡沫消失之后，在杯壁上残留的白色絮状物。优质啤酒残留的白色絮状物越多，反之则少。不挂杯的啤酒是质量不好啤酒。4．4结果与分析4．4．1突变菌株的发酵性能实验4．4．4．1突变株的发酵力、双乙酰含量的测定发酵力是酵母菌株发酵能力的重要衡量指标，快速有效的发酵才能适用于大批量的啤酒生产。双乙酰是啤酒风味的主要影响因素，它在啤酒中含量较高，阈值低(小于0．15mg／L)，对啤酒风味影响很大，超过阈值时啤酒呈饭馊味。在前面实验中筛选出的18株突变株与出发菌株同时做发酵实验，比较发酵力和双乙酰含量结果如表4—3。39 低产蛋白酶．4酵母菊株的选育及中试酿造的研究表4-3突变株的发酵力(总失重量)和双乙酰含量比较Tab．4·3ThecomparisionoffermentstrengthanddiacetyIcontentofmutant由表可以看出：(1)与出发菌株相比较，突变株EH78的总失重量偏低，表明其不能很好的进行发酵。(2)除了EH78，其余突变株的总失重量与出发菌株相比，变化幅度不大，这表明突变菌株的发酵能力基本接近于出发菌株。(3)大多数突变株的双乙酰含量接近于出发菌株，只有GMl61的含量略高于阂值，说明其双乙酰还原能力稍差。所以将突变株EH78和GMl61淘汰，其余16株菌株进行下一步的实验。4．4．4．2突变株风味物质含量的测定啤酒常规检测的风味物质包括：乙醛、DMS、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯等。将筛选出的16株突变株与出发菌株同时做发酵实验，发酵液中各种主要风味物质的比较结果如表4—4。表4-4突变株风味物质含量的比较(mg／L)Tab．4．4Thecomparisonoftheflavourmaterialcontent(rag／L) 新疆农业大学硕士学位论文通过表4-4总体比较，突变株的风味物质含量的变化波动范围较小，与出发菌株的各项风味物质指标相接近。以风味物质的主要指标异戊醇来看，低于出发菌株的突变株有：GM05、GM201、GM237、GM239，其中GM05、GM239的异戊醇含量分别降低15．25mg／L、13．89mg／L；异戊醇含量接近于出发菌株的突变株有：NL30、NL38；其余的突变株异戊醇含量均稍高于出发菌株，其中GH88的增幅最大，为21．99mg／L。4．4．4．3突变株蛋白酶A活力的测定4．4．4．3．1荧光底物法标准曲线(如图4—1)45．OO40．0035．00望30．00复25．00光20．oo值15．oolO．005．00O．00O0．0000020．0000040．0000060。000008O．00001蛋白酶活力(U／m1)图4-1蛋白酶A荧光强度标准曲线Fig．4-1ThestandardcurveoftheProteinaseAfluorescencestrength41 低产蛋fi酶4酵母葡抹的选育及中试酿造的研究4．4．4．3．2突变株蛋白酶A活力检测结果将筛选出的16株突变株与出发菌株做对比发酵实验，发酵液的蛋白酶A活力比较结果如表4-5。表4-5突变株蛋白酶A活力比较Tab．4-5ThecomparisonofproteinaseAvitality由表4—5可以看出，大部分的突变株的蛋白酶A活力对比出发菌株无明显降低或略高，只有GH45、GH46、EH88、GM235的酶活力降低约6"---26％左右，各项性能指标较稳定，所以选择GH45、GH46、EH88、GM235进行下一步的遗传稳定性实验。4．4．4．4遗传稳定性实验的结果将筛选出的突变菌株GH45、GH46、EH88、GM235在麦汁斜面上连续传5代，第五代突变株进行三角瓶发酵试验，每日测定失重量，发酵结束后测定最终发酵液的双乙酰含量、蛋白酶A活力及各项风味物质的含量，将上述突变株的检测数据与出发菌株对照，结果分析如表4-6，表4—7。表4-6突变株第五代的发酵性能指标及蛋白酶h活力比对Tab．4-6ThecomparlsorloffifthgenerationmutantswithfermentationperformanceandproteinaseAvitality菌株名称总篙量配(rag酗／L)原魏鬈磊器)酶繁率出发菌株H6·75仉1368届3吼14×10二～6．340．1466．748．66×10一——GH456．600．1371．629．88×10{—— 新疆农业大学硕t学位论文皇舅曼皇舅--II_II．皇曼蔓曼鼍曼曼曼!曼!曼!曼曼曼曼曼!舅舅．由表4-6可以看出，突变株第五代的总失重量与出发菌株相接近，其中GM235的总失重量最大、速率最快；突变株第五代的双乙酰还原情况与出发菌株接近，其中EH88双乙酰含量最低，其余次之；大部分突变株第五代的蛋白酶A活力较出发菌株降低，其中GM235的降低幅度最大，平均达到34．57％，而突变株GH45传代5代后，蛋白酶A活力没有降低，反而略高，说明该突变株的变异遗传性能较差，不适于连续生产。综合分析发酵性能指标及蛋白酶A活力降低情况，以突变株GM235性能最佳。表4_7突变株第五代的各项风味物质含量(叫L)比对Tab．4·7Thecomparisonoffifthgenerationmutantswithflavourmaterialcontent综合分析风味物质指标(主要比较异戊醇、乙酸乙酯)，突变株GM235的异戊醇含量较出发菌株平均降低11．49mg／L，乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇等指标均与出发菌株相接近，适于酿造出低醇高酯，具有较好风味的啤酒，是较为理想的突变菌株；尽管突变株GH46的异戊醇含量降低幅度达27．95mg／L，但其乙醛含量偏高，故不是最理想的菌株；突变株GH45的正丙醇含量略低，但异丁醇含量偏高，其余指标与出发菌株接近，不是理想菌株；虽然GH88的各项风味指标均与出发菌株相接近，符合酿造要求，但不如GM235可达到低醇高酯，故也不理想。43 低产蛋n酶^酵母菌株的选育及中试酿造的研究综上所述，采用GM235进行中试啤酒发酵实验。4．4．2突变菌株的中试试验4．4．4．1中试发酵过程中糖度、酵母数、双乙酰还原能力的测定结果中试发酵过程中突变菌株GM235和出发菌株H糖度变化情况如图4一l，酵母数的变化情况如图4-2，第5天开始升压排酵母，故只保留前6天的数据。双乙酰还原能力的比较如图4—3。12．0010．OO乱8．00魁6．00舞4．oo2．000．00l23456发酵天数(d)+出发菌株—·一突变菌株图4．1突变菌株GM235与出发菌株H在发酵过程中糖度变化比较Fig．4一lThecomparisonofsugarconcentrationofmutantGM235andoriginalstrainH由图4-1可以看出出发菌株H的降糖速度稍快，但总降糖量与突变菌株GM235基本相等，分别为8．56。P和8．60。P。90．O80．O，、70．0-j{60．0250．0籁40·O亩30．0越20．010．O0．0123456发酵天数(d)图4-2突变菌株GM235与出发菌株H在发酵过程中酵母数变化比较Fig．4-2ThecomparisonoftheyeastnumberofmutantGM235andoriginalstrainH由图4-2可以看出突变株GM235和出发菌株H的酵母数变化趋势相同，在第三天达到最高值，突变菌株为7840万，出发菌株为6760万个，然后逐步下降，突变株GM235 耨疆农监大学硕}?学位论文的增殖速度略高于出发菌株H。O．450．40o0．35＼誉0．30嘲0．25鑫o．20闷0．15鼷0．100．05O．00l23456789发酵天数(d)出发菌株突变菌株图4-3突变菌株GM235与出发菌株H在发酵过程中双乙酰含量比较Fig．4-3ThecomparisonofthediacetyofmutantGM235andoriginalstrainH由图4-3可以看出，在前四天的发酵过程中，突变菌株GM235的产双乙酰能力基本略高于出发菌株H，在第五天达到最高值，突变株GM235为0．34mg／L，出发菌株为0．39mg／L，从第5天起出发菌株的双乙酰含量始终高于突变菌株，在第8天达到标准要求≤O．1mg／L，发酵终止时两者含量基本一致，说明突变株GM235的双乙酰还原能力高于出发菌株H，可以有效地降低啤酒中双乙酰含量，改善啤酒的风味。4．4．4．2中试发酵结束后发酵度和风味物质的测定结果中试发酵结束后突变菌株GM235和出发菌株H的发酵度比较如图4-4，风味物质含量比较如表4—8。80．OO％70．00％60．00％50．00％40．OO％30．00％20．00％10．00％O．OO％出发菌株突变菌株图4-4突变菌株GM235与出发菌株H在发酵结束后发酵度的比较Fig．4-4ThecomparisonofthefermentrateofmutantGM235andoriginalstrainH由图4—4可知，突变菌株GM235的发酵度69．4％与出发菌株H的69．8％相接近，巡链越 低产蛋e|酶A酵母荫株的选育及巾试酿选的研究且发酵周期相同都为九天，能达到工业化生产的要求。表4—8突变菌株GM235与出发菌株H在发酵结束后风味物质含量比较Tab．4·8ThecomparisonoftheflavourmaterialcontentofmutantGM235andoriginalstrainH由表4—8可知中试发酵后，突变株GM235的啤酒各项风味物质含量与出发菌株H的风味物质含量相接近，除正丙醇稍高外，异丁醇、异戊醇、活性戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯的含量均略低，其中异戊醇降低5．03％，总高级醇降低4．87％。4．4．4．3中试发酵过程中及发酵终止蛋白酶A活力的测定结果中试发酵过程中蛋白酶A活力的变化情况如图4-5，发酵终止的蛋白酶A活力比较结果如表4-9。0．0100逞0．0080o吕R0．0060烬藩0．0040-z跚0．00200．OOoo口出发菌株口突变菌株lZ3456789发酵天数(d)图4-5突变菌株GM235与出发菌株H在发酵过程中蛋白酶A活力比较Fig．4-5ThecomparisonoftheProteinaseAvitalityofmutantGM235andoriginalstrainH由图4—5可以看出，在整个发酵过程中，影响酶活力的因素较复杂，蛋白酶A活力起伏不定，总体趋势增强。突变株GM235的蛋白酶A活力在中试发酵过程中始终低于出发菌株H。 额疆农啦大学硕}=学位论文IIII量曼曼曼曼曼曼皇曼曼寰曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼!曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼!曼曼寰曼曼曼曼曼曼舅量蔓曼曼苎!皇曼曼曼!曼曼舅曼舅曼曼曼曼皇表4—9突变菌株GM235与出发菌株H在发酵终止的蛋白酶A活力结果Tab．4·8ThecomparisonoftheProteinaseAvitalityofmutantGM235aridoriginalstrainHintheend由表4—9可以看出，发酵终止后突变株GM235的蛋白酶A活力明显低于出发菌株H，降低率达19．31％，效果显著，确定为低产蛋白酶A的突变菌株。4．4．4．4泡沫综合指标的测定(1)啤酒的起泡性：将突变菌株GM235的发酵液注入玻璃杯中，酒液上部有大约2／3容量的泡沫，泡沫洁白细腻，状似奶油，说明起泡性良好。(2)啤酒泡沫的持久性：将突变株GM235发酵液与出发菌株H发酵液分别注入玻璃杯中，测量自泡沫形成至泡沫崩溃所持的时间，突变株发酵液泡持时间为210s，出发菌株发酵液泡持时间为120s，可以对比得出突变株发酵液泡持性优于出发菌株发酵液。(3)啤酒泡沫附着力：将突变株GM235发酵液注入玻璃杯中，然后慢慢倒去，观察酒杯内壁，有均匀分布的残留泡沫，这说明啤酒泡沫的附着力良好。4．4．4．5啤酒的口感品尝由国家啤酒评品专家品尝两种啤酒口感如下：出发菌株H：口感较淡、略有涩味和高级醇味；突变菌株GM235：口感较为协调、柔和、淡爽，酯香好。4．5本章小结(1)通过初筛和复筛实验得到的蛋白酶A活力降低的18株突变株，经过对其发酵性能和蛋白酶A活力试验，得出4株突变株GH45、GH46、EH88、GM235表现出较47 低产蛋fj酶j4酵母强株的选育及中试豫遗的研究好的发酵性能和低蛋白酶A活力特征。(2)将突变株GH45、GH46、EH88、GM235进行遗传稳定性的实验，有3株突变株GH46、EH88、GM235传代五代后表现出较稳定的蛋白酶A活力降低，其中GM235的各项发酵性能良好、风味物质含量和蛋白酶A活力降低表现稳定，被确定为目的菌株进行中试酿造试验。(3)中试发酵结果表明：突变菌株GM235的突变菌株的降糖速度略快，总降糖量与出发菌株H基本相等，酵母增殖速度略高于出发菌，双乙酰还原能力高于出发菌株，表明其发酵性能略好于出发菌株；发酵度与出发菌株接近，发酵周期相同，啤酒各项风味物质含量与出发菌株H的风味物质含量相似，除正丙醇稍高外，异丁醇、异戊醇、活性戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯的含量均略低，异戊醇降低5．03％，总高级醇降低4．87％，可以达到工业化生产的要求。(4)突变株GM235的蛋白酶A活力在中试发酵过程中始终低于出发菌株H，发酵终止时突变株GM235的蛋白酶A活力明显低于出发菌株H，降低率达19．31％，效果显著。且泡沫起泡性和附着力，泡沫持久性强，持泡时间210s，远高于出发菌株H的120s；口感较为协调、柔和、淡爽，酯香好。通过以上结果确定突变株GM235为低产蛋白酶A的酵母菌株，并适用于工业生产。 新疆农业大学硕：卜学f,-7_论文5．1结论第五章结论与展望(1)He—Ne激光诱变对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株无效果，不建议使用用于筛选低产蛋白酶A活力的酵母菌株。(2)亚硝酸诱变酵母菌株的最佳条件是：0．1mol／L亚硝酸钠，pH4．5醋酸缓冲液，诱变最终浓度0．025mol／L，处理lOmin；亚硝酸诱变对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株有一定效果。但筛选出的2株突变株NL30和NL38在验证实验中未表现出低蛋白酶A活力。(3)亚硝基胍诱变酵母菌株的最佳条件是：诱变最终浓度lmg／mL亚硝基胍，pH6．0磷酸缓冲液，处理20min。NTG对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株有较好效果，筛选出4株突变株GH45、GH46、GH65和GH69，其中只有GH46的低蛋白酶A活力表现稳定，传代5代后酶活降低率平均值为11．2296。(4)EMS诱变酵母菌株的最佳条件是：诱变最终浓度最终浓度30I．tL／mL，诱变处理30min。EMS对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株有较好效果，筛选出2株突变株EH78和EH88，其中EH88低蛋白酶A活力表现稳定，传代5代后酶活降低率平均值为21．39％。(5)连续采用亚硝基胍和EMS诱变对于筛选低产蛋白酶A的啤酒酵母菌株有很好的效果，初筛的42株突变株在进行蛋白酶A活力检测时，有10株表现出较好的发酵性能及低蛋白酶A活力。突变株GM235的低蛋白酶A活力表现稳定，传代5代后酶活降低率平均值为34．5796。故采用连续诱变的方法对于选育低产蛋白酶A的菌株最有效，酶活降低率最高。(6)通过比较两种初筛实验的筛选效果，发现采用酸变性血红蛋白平板实验要比羧肽酶Y平板染色鉴定筛选结果明显，最后确定酸变性血红蛋白平板实验是诱变选育低产蛋白酶A菌株的最佳初筛方法。(7)将18株突变株进行发酵性能实验和遗传稳定性的实验，最终得出突变株GM235的各项发酵性能良好、风味物质含量和蛋白酶A活力降低表现稳定，被确定为 低产蛋自戆A酵母璃株的选胃硬巾试酿造的研究目的菌株。(8)中试试验结果表明突变株GM235的各项发酵性能优于出发菌株H，且发酵终止时蛋白酶A活力明显低于出发菌株，酶活降低率为19．31％，具有很好的工业应用前景。5．2展望(1)需进一步研究蛋白酶A对纯生啤酒泡沫稳定性的影响途径，确定泡沫蛋白随不同活力的蛋白酶A而发生变化的情况，从理论上建立蛋白酶A活力与泡沫蛋白间的关系，进一步确定蛋白酶A对于纯生啤酒泡沫稳定性的作用。(2)通过图位克隆来定位分析突变株的PEP4基因是否发生突变，以及精确突变位点。(3)突变菌株如用于工业生产，还需进行最佳工艺路线的摸索，对最佳温度、pH值、辅料比等进行深入地研究。 新疆农q址大学硕}=学位论文参考文献[1]Barnfo曲．C．W．，Thefoamingpropertiesofbeer[J】．JInst．Brew,1985，91：370-377[2]StephanE．Brey'JamesH．Bryce，VincentJ．Higgins，PeterJ．Rogers&GrahamGStewart．Expression，activationandsecretionofyeastproteases—minimizingtheirimpactonbeerfoamandstability【J】．Proceedingsofthe29mEBCCongressDUBLIN，2003，503—510．[3]StewartGG，A．Mader，P．Chlup，andM．Miedl．TheInfluenceofProcessParametersonBeerFoamStability【J】．MBAA硷，2006，43(1)：4硝1[4]Hata,T．，Hayashi，IL，&Doi，E．Purificationofyeastproteinases．PartI．Fractionationandsomepropertiesofproteinases【J】．Agric．BioLChem．1967，3l(2)：150-159[5]Brey，S．E．，Bryce，J．H．，&Stewart,GGThelossofhydrophobicpolypeptidesduringfermentationandconditioningofhighgravityandlOWgravitybrewedbeer【J】．JlnstBrew．2002，108(4)：424-433[6]Brey,S．E．，Costa,S．，Rogers，P．1．，Bryce，J．H．，Morris，P．C．，Mitchell，W：J．，&Stewart,GGTheeffectofproteinaseAonfoam-activepolypeptidesduringhighandlowgravityfermentmion【J】．JInst．Brew．2003，109(3)：194-202[7]Cooper，D．J，Stewart,GG&Bryce，1．H．SomereaSOllSwhyhighgravitybrewinghasanegativeeffectonheadretention【J】．Jlnst．Brew．1998，104：83-87[8]Cooper，D．J．，Stewart,QG&Bryce，J．H．Yeastproteolyticactivityduringhighandlowgravitywortfermentationsanditselectonheadretention嗍．Zlnst．Brew．2000，106：197-201[9]Dreyer，T．，Biedermann，K．&Ottesen,M．Yeastproteinaseinbeer叨．CarlsbergRes．Commun．1983，48：249～253[10]Kogin，A．，Fuhui，N．，Furukobo，S．，Yomo，H．，Kondo，H．，Isoe,A．&Amachi，YRegulationofproteaseactivityinbeer【J】．死幽．QMasterBrew．Assoc,Am．，1995，36：67-70[11]Muldbjerg，M．，Meldal，M．，Breddam，K．&Sigsgaard，PProteaseactivityinbeerandco,albionoffoam[J】．InEuropeanBreweryConventionProceedingofthe25。Congress．OxfordUniversityPress，NewYork．1993，357-364[12]Ormrod，L．H．L．，Lalor,E．E，&Sharpe，E．R．Yeastproteolyticenzymeactivityduringfermentation【J】．EuropeanBreweryConventionProceedingofthe25。Congress．Lisbon．IRLPress，Oxford．1991，457--464[13]Y．0koi，S．，Shigyo，T．，&Tamaki，T．AfluorometricassayforproteinaseAinbeeranditsapplicationforinvestigationofenzymaticeffectsonfoamstability叨．dlnsLBrew．，1996，102(1)：33～37[14]余俊红，樊伟，史嫒英，郝俊光．啤酒中蛋白酶A的研究进展[J]．酿酒，2005，32(5)：53-59[15]张峻炎．纯生啤酒泡沫稳定性的研究：[硕士学位论文]．无锡：江南大学[16]Lenney,J．E，Matiie，EWiemken，A．，Scheilenberg,M．，&Meyer，J．ActivitiesandcellularIoclizationofyeastproteinasesandt11eirinhibitors【J】．Biochem．Biophys．Res．Commun．，1974，60(4)：1378～1383[17]Teichen，U．，Mechler,B．，Muller,H，eta1．Lysosomal(vacuolar)proteinaseofyeastareessentialcatalystsforproteindegradation，differentiation,andcellsurvival【J】．J．Bi01．Chem，1989，264(27)：16037"16045[18]Jones，E．W．，ThreeproteolyticsystemsintheyeastSaccharomyceseerevisiae【J】．J．Bi01．Chem，1991，266(13)：7963"-'7999[19]Harris，S．D．，CoRer’D．A．Vavuolar(1ysosomal)trehalaseofSaccharomycescerevisiae【J】．Curr．Microbiol，1987，15(5)：247～2495】 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靳疆农幢大学硕t学位论文致谢本课题的研究在导师傅力副教授和王德良高级工程师的精心指导下完成的。从课题的选定到研究工作的进展，直至毕业论文的最后审阅，傅老师和王老师始终关怀备至。恩师渊博的知识、严谨的治学作风、忘我的工作热情使我永生难忘，你们在传授我知识的同时，更让我学会了许多做人的道理，在论文完成之际，谨向尊敬的导师致以崇高的敬意和诚挚的感谢!以及对他们的家人表示由衷的感激和深深的祝福。非常感谢中国食品发酵工业研究院的张五九院长、薛洁工程师、要永洁工程师等全体工程师给了我学习、生活上很大的关心和帮助，在这个实验室学习和工作让我体味到家的亲切。感谢胡京奕、李涛、孙志伟、李海峰给予了无私的帮助和热情的指导，使我的论文工作得以顺利进行和完成。．广州珠江啤酒公司的吴小映对本文部分实验和检测给予了许多有益的帮助和指导，在此表示衷心的感谢。特别感谢王辉、刘宁、李建飞同学和北京农业职业学校的老师对实验的大力支持，使我的实验能够顺利进行。感谢贾娟、陆晓慧师姐和任海波、赵传仕师兄对我的帮助，感谢冯玮、郑素慧、冯利兴、任娟、闫国红等同学的真诚相对，感谢内蒙古农业大学陈利娜、胡桂林、新疆大学张雪峰同学，一年半中我们在一起学习和工作，建立了深厚的感情。感谢师妹陈旭、王晓娟、王志萍，和你们在发酵院实验室一起学习和生活，轻松而惬意，我会永远记住和你们一起度过的快乐时光。同时感谢我院全体同学们衷心祝愿你们今后一切顺利，也深深祝福在天国的张鹏同学。感谢新疆农业大学食品科学学院所有领导和老师们的关怀和支持!最后，深深的感激父母数十年的辛勤劳作和教育，叮咛和嘱托，祝愿我们全家健康、幸福!张卓2008年5月乌鲁木齐·新疆农业大学 新疆农、lk大学硕十学位论文作者简历姓名：张卓性别：女出生年月：1979．04族别：汉最后学历：硕士研究生籍贯：辽宁毕业院校：新疆农业大学食品科学学院工作经历：2001年10月--2004年10月旺旺集团沈阳粮旺粮油制品有限公司2005年3月--2005年8月沈阳伊利乳业有限责任公司．2006年8月--2008年3月中国食品发酵工业研究院(实习)发表论文：1．张卓，王德良，傅力，王辉．优化亚硝基胍(NTG)诱变条件选育低产蛋白酶A菌株的研究．酿酒，2008，35(1)：88-90．2．傅力，张卓，王德良，杨静．低产蛋白酶A啤酒酵母的诱变选育及在啤酒中试发酵中应用的研究．(已被食品工业科技2008年第8期录用)3．王辉，赵晨霞，冯作山，张卓．采前栽培技术措施对酿酒葡萄品质的影响．(酿酒送审中)57 低产蛋白酶A啤酒酵母的选育及在啤酒中试酿造中的应用作者：张卓学位授予单位：新疆农业大学本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1256759.aspx