[精品]生物实验技术.doc

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1、第3章现代生物学实验技术细胞培养技术3.1细胞培养是指动物、植物和微生物在室内无菌条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要求等方血有许多養异，但是作为细胞培养它们有共同Z处。首先,要求在无菌的条件下进行培养。从取材到分离细胞都必须在严格的无菌状态下完成，实验室和超净工作台实验前示应消毒一次，实验所用的一切器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌，实验者的双手应戴无菌手套。其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌示再接入活细胞或纟R织。最示将接种示的培养基放入培养室或培养箱屮，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件，如

2、pH值、湿度、温度、光照、氧气及二氧化碳等，当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。3.1.1液体培养生长动力学研究常利用液体培养进行，许多细胞可用同种单细胞悬浮液在合适的液体培养基屮生长，其生长特性常用细胞数目(群体生长)来衡量，而不用细胞大小。大多数液体培养系统需要在恒温、恒湿和振荡的条件下进行。实验室内可利用100〜2000mL容量的三角瓶在20〜250r/min的摇床上分批培养。对于需氧细胞，培养基的最不要超过三角瓶体积的20%,以保证培养液的上表瓯有足够的氧气有的情况下还要通入无菌空气，促进气体交换。液体培养系统有两种

3、类型：分批培养与连续培养。(1)分批培养这是常规液体培养最普遍的方法。将细胞接种到一定体积的生长培养基中，进行培养。细胞的生长呈S形生长曲线(图3-1),可分为四部分。%1延滞期是细胞生长的起始阶段，细胞数目没有增加。在相同培养条件下，接入的活跃细胞数量越多，延滞期越短。%1对数期(或指数期)细胞以最大速率生长，可用生长速率常数或比生长速率(u)来衡量。由于对数期细胞的生长、代谢基本一致，因而常用做实验材料。%1稳定期由于营养物质耗尽而有害物质积累致使生长速率降低。细胞增殖的数目与死亡的数目相抵消。在动物细胞培养屮，该期通常称为

4、“平台期”。%1衰减期(或死亡期)如果细胞没有继代，则会因长期饥饿和屮毒而死亡。与生长一样，细胞死C随时间延长也呈指数变化，可以用死亡速率常数来表示，其值与生长速率常数相等。另一种常用的表示方法是存活时间(d或T90,decimalreductiontime),即群体细胞数目减少90%时所需耍的时间。有些细胞在稳定期结束时发生快速H溶现象，而另一些细胞的死亡速率则较慢。分批培养法可用来保持特定物种的原种；在细胞进入衰减期Z前，就要转入新鲜培养基中继代。(2)连续培养这是一种在固定容积的培养容器屮连续加入新鲜生长培养基，从而延长细

5、胞指数生长期的方法。容器接种后，培养物以分批培养的方式生长一段时间，当群体大小达到一定稈度时，即泵入培养基。该系统经过设置，即达到细胞生长所增加的数目等于与因稀释而相对减少的数日，即容器屮的细胞数甘维持在稳定的状态。细胞以特定的比生长速率(u)生长，同时被相等稀释速率(D)抵消。3.1.2测定培养细胞的生长广泛采用的生长测定方法是基于细胞的数目。测定生长的其他方法包括测定生物量、干重、浊度、吸光度或任何细胞内主要组分（如蛋白质、核酸、ATP等）的含量。（1）显微镜直接计数法测定生长的最简单的方法是利用显微镜和血球计数板统计已知体

6、积的培养基屮的细胞数目（图文框3・1）。该方法能快速估计总的细胞数目，但不能区分活细胞和死细胞，区分个体细胞如团块屮的细胞也十分困难。⑵培养计数法许多培养技术可用来测定样品屮微生物的数忖。其基本原理是：在适宜的条件下，有活力的单个微生物细胞能够在生长培养基屮增殖成菌落。如测定琼脂培养基上的菌落计数法或测定液体培养基的浊度计数法。常用的几种方法如下。%1涂布平板或倾注平板法（“平板计数法”）最常用的方法是将适当浓度、适量的样品转移到琼脂培养基上，在适宜的条件下培养，然后计数菌落。・1%1膜过滤法对于细胞数目低于10CFU・mL的细

7、菌样品可用无菌滤膜过滤（孔径为0.2um或0.45uin）,然示将滤膜放在合适的培养基屮培养，肓至长出菌落。用被过滤的样品体积除以由每个滤膜产生的平均菌落数得到样品屮的总细菌数。%1复管计数法或最大概率数（mostprobablenumber,MPN）法将样品稀释，取一定体积转移到盛有液体培养基的几个试管屮（通常3个体积单位分装5个管）。经培养后，将表现出生长（浊度）的试管数目与统计表屮数值相比较，得到最大概率数・1（MPN・mL）。培养计数法的基木优点是不会计数死细胞。但在这些技术中，由于培养基和培养条件可能不适丁所冇细胞的生

8、长，因而可能低于真实值。细胞聚集为团块和稀释错误也会产生新的问题。另外，这些方法需要无菌的设备和培养基，并且需经较长时间的培养才能得到结果。还有一种方法是将“活体”染色或“致死”染色在显微镜下肓接计数。受伤害或受胁迫微生物计数前，将微生物放在选择条件下生长，使其