生物技术概论-基因工程(ppt137).ppt

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1、生物技术概论基因工程南方医科大学生物技术学院马骊二〇〇六年五月十一日重组DNA技术的定义将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程的定义重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯

2、化过程。基因工程的理论基础不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件如启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列——分子生物学原理筛选、修饰蛋白质生物合成的翻译调控元件如SD序列、mRNA非编码区、密码子基因工程菌的增殖及稳定生产——生化工程学原理——分子生物学原理基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术

3、DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术基因工程的基本条件C目的基因B基因克隆载体A用于核酸操作的工具酶D用于基因转移的受体菌或细胞A用于核酸操作的工具酶限制性内切核酸酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性内切核酸酶一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P的DNA片段的内切脱氧核苷酸酶。基因工程中所用的是II型酶。属名种名株名HindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株

4、同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如：EcoRI的识别序列为：GAATTCCTTAAG1、限制性内切酶的识别顺序限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称为识别序列。识别序列多由4-6个核苷酸对组成，呈典型的旋转对称型回文结构。有的限制性内切酶可识别2种以上的核苷酸序列。如：AccI既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC在限制性内切酶的作用下，DNA双链上磷酸二酯键断开的位置称为酶切位点，用表示。酶切位点位于识别序列的内部或两侧。如：GAATTC、GATC。2、限制性内切酶的酶切位点不同的酶切

5、割DNA分子后产生的末端不同：5’粘性末端、3’粘性末端、平末端。如：EcoRI产生5’粘性末端:5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’PstI产生3’粘性末端：5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-

6、C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PvuII产生平末端：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’同裂酶：有些限制性内切酶虽来源不同，但具有相同的识别序列，酶切位点不同或相同。如：BamHI和BstI：识别GGATCC

7、。同尾酶：有些限制性内切酶虽识别序列不同，但酶切产生的DNA片段具有相同的末端。如：TaqI、ClaI和AccI，酶切均产生5’-CG末端。限制性内切酶酶切反应的操作大部分限制性内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100ulTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1hr，完全水解1mg标准DNA所需的酶量。限制性内切酶的多酶联合酶切对盐浓度要求相同的酶，

8、原则上可以同时酶切，但应注意：5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’…GCTAC